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Tips, Tricks, and Potential Pitfalls of CRISPR Genome Editing in Saccharomyces cerevisiae
作者：Jacob S. Antony 1, John M. Hinz 1 and John J. Wyrick
这篇综述广泛地集中在各种CRISPR技术在操纵酿酒酵母基因组方面的应用，并描述了有效编辑的各种实验技巧和技巧，以及如何避免与CRISPR靶向相关的潜在诱变陷阱。
影响cas9基因组编辑结果的细胞因素
至关重要的是，酿酒酵母中的CRISPR基因组编辑必须在包装到染色质中的DNA靶位点内发挥作用。染色质的基本构件是核小体，其中大约147 bp的DNA围绕八聚体组蛋白包裹大约1.67次。因为许多DNA酶，包括DNA甲基转移酶、限制性内切核酸酶和DNA修复蛋白，在体外和体内都大大降低了对核小体DNA底物的活性。所以表征真核核小体如何影响原核CRISPR酶的编辑效率是重要的。
最初的体外研究表明，即使DNA包装到核小体中，包括染色质中最低水平的DNA包装，也能显著抑制靶位点的Cas9切割。核小体对Cas9核酸酶活性的影响取决于多种因素，包括核小体定位强度、PAM基序和靶位点相对于核小体的位置(图3A)，以及ATP依赖性核小体重塑酶的存在。
核小体对Cas9核酸酶活性的影响取决于多种因素，包括核小体定位强度、PAM基序的位置和相对于核小体的靶位点(图3A)，以及ATP依赖性核小体重塑酶的存在。例如，PAM位于强定位核小体内的目标位点对Cas9体外裂解是难处理的。
核糖体对Cas9核酸酶活性的影响取决于多种因素，包括核糖体定位强度、PAM图案和靶点相对于核糖体的位置（图3A），以及ATP依赖的核糖体重塑酶的存在。例如，PAM位于强定位的核糖体内的靶点，在体外不容易被Cas9裂解。相反，位于相邻连接体的PAM位点仍然可以被有效地靶向和裂解，即使目标位点的其余部分位于核糖体内部。这表明PAM在染色质中的可及性是调节Cas9靶向和裂解的一个关键因素。此外，依赖ATP的核糖体重塑酶的存在，可以转移核糖体的位置，或内在的核糖体[1]，特别是在位置较弱的核糖体DNA末端附近，也可以促进Cas9对核糖体DNA底物的裂解（Horlbeck等，2016；Isaac等，2016）。有趣的是，Cas9在含错配的非目标位点的活性往往比在完全匹配的目标位点的活性更受核糖体的抑制，这表明染色质在某些情况下可能通过抑制非目标裂解来促进Cas9的特异性。
越来越多的证据表明，染色质会影响细胞内Cas9的编辑效率。例如，酵母中核小体缺失的区域更容易被Cas9核酸内切酶切割，实验性地减少酿酒酵母中HO和PHO5启动子的核小体，增强了Cas9切割活性。这与先前在其他真核细胞中的研究一致，表明Cas9核酸内切酶活性和无催化活性的死Cas9 (dCas9)结合在富含核小体的异染色质区域比核小体更少的常染色质区域更受抑制(图3B)。有趣的是，这表明常染色体区域，特别是启动子附近，可能是Cas9脱靶诱变的靶位。最近的一份报告表明，其他CRISPR酶(即Cas12a)的活性也可以在体外被核小体抑制(Strohkendl等人，2021)。综上所述，这些发现表明活细胞中的染色质环境代表了一个重要的决定因素，即如何成功地实现预期的基因组编辑结果。
酵母CRISPR基因组编辑的实际考虑
酵母中的CRISPR基因组编辑通常涉及转化表达活性Cas9基因和指导RNA (gRNA)以及供体模板的质粒(DiCarlo等人，2013；罗伊等人，2018)。在这里，我们描述了在酵母中成功进行CRISPR/Cas9基因组编辑实验的几个实际考虑因素，包括优化gRNA设计、表达和递送以及在酿酒酵母中表达Cas9。我们还提供了几种质粒系统的概述，这些质粒系统已被开发用于在酵母中表达化脓性链球菌Cas9或其他CRISPR酶，以及它们相应的gRNA。此外，我们讨论了如何通过使用替代Cas蛋白来克服Cas9靶向的局限性。通常，基因组编辑实验将gRNA和Cas9作为低拷贝(每个细胞约1-4个拷贝)或高拷贝(每个细胞约30-60个拷贝)质粒，或通过整合到基因组中引入酵母细胞。
gRNA设计最常见的方法是利用嵌合的单一指导RNA (sgRNA)，它将细菌中CRISPR系统采用的双gRNA系统的靶向crRNA元件与激活tracrRNA元件融合(Jinek等人，2012)。这些sgRNAs允许与Cas9核酸内切酶形成稳定的复合物，该复合物被引发用于DNA靶向(Jiang等人，2015)。sgRNA在酵母中的表达通常通过从RNA聚合酶III (Pol III)启动子转录sgRNA基因来实现，因为使用Pol III避免了与RNA聚合酶II转录相关的转录物切割和聚腺苷酸化，这将对sgRNA功能不利，并且因为Pol III启动子高水平转录小RNA(Kabadi等人，2014)。其他sgRNA的表达方法包括使用与tRNA相关的顺式调控元素的转录本，同时使用核酸酶在其5'端裂解转录本（Ryan和Cate，2014年；Ryan等人，2014年）或使用Pol III启动子，其两侧是核酸酶，将裂解RNA的两端（高和赵，2014年）。或者，一些研究已经从两个单独的Pol III启动子分别表达了crRNA阵列和tracrna(Bao等人，2015)。在酵母中表达sgRNA最常见的启动子和终止子组合涉及pSNR52 snoRNA启动子和酵母tRNA基因SUP4终止子（图4B）。有趣的是，其他研究表明，不同的Pol III启动子，如pSNR6、pSCR1和pRPR1，其编辑效率相对于pSNR52较低。因此，我们建议，在S. cerevisiae中，sgRNAs由pSNR52启动子表达。SUP4终止子基本上是一串T核苷酸（即5'-TTTTTGTTTT TT-3'）。这将导致Pol III转录的终止。如果引导段含有多个胸苷核苷酸，Pol III转录的这一特点就会出现问题，因为这些会导致过早终止，从而导致sgRNA的弱表达。这在sgRNA的20 nt引导段的3'端附近尤其成问题，因为这紧邻sgRNA的结构段，其中包含一个长的T段（即5'-GTTTT ...）。这与一些研究报告相一致，这些报告显示，靠近sgRNA引导段3'端的T（或U）核苷酸会导致表达不良（Wu等人，2014；Xu等人，2015），从而导致Cas9裂解效率低。这会导致在用Cas9和sgRNA质粒转化后，即使没有供体模板，也会出现未被编辑的背景菌落，因为Cas9对目标位点的重复裂解导致负选择被削弱了。这个问题在一定程度上可以通过在转化板上挑选较大的菌落来弥补，因为我们已经发现这些菌落更有可能被编辑。然而，如果编辑效率仍然太低，将sgRNA重新设计为更有利的靶向序列也是一个实用的解决方案（Laughery和Wyrick，2019）。另一个选择是使用高表达的RNA聚合酶II（Pol II）启动子（Nødvig等人，2015）。
在酿酒酵母中进行基因组编辑实验的另一个重要实验考虑涉及基因组编辑蛋白--化脓性链球菌Cas9内切酶如何在酵母细胞中表达。由于Cas9在真核细胞的细胞核内表达，其表达载体一般需要一个核定位信号（NLS），如SV40 NLS，它与Cas9的Nor C端融合（图5A）。其他重要的考虑因素包括Cas9基因是否被优化为在酵母中表达，表达Cas9的启动子的强度，以及表达方法（低拷贝数与高拷贝数质粒等）（图5A）。无论选择何种方法在活酵母细胞中表达Cas9，很高水平的Cas9表达可能会诱导细胞毒性（Ryan等人，2014；Generoso等人，2016）。然而，这种情况的发生程度可能在一定程度上取决于所选酵母菌株的固有遗传背景以及Cas9表达方法，因为其他研究表明，Cas9的高组成表达通常不具有细胞毒性（Gao和Zhao，2014；Bao等人，2015；Laughery等人，2015）。
通常，许多CRISPR编辑实验中的限速步骤是克隆sgRNA构建体中特定的20nt引导片段，以靶向感兴趣的基因组区域。这个20nt引导片段位于sgRNA的5'端，紧接着启动子驱动引导RNA表达之后。
因此，有效地将20nt引导片段引入到sgRNA表达构建体中的适当位置可能具有挑战性。已经开发了许多不同的实验策略，以促进将片段克隆到sgRNA表达构建体中。我们自己设计和克隆新的20mer靶向引导序列的方法涉及使用独特的内部限制性酶位点（BclI和SwaI），这些位点允许快速定向克隆杂交寡核苷酸，其一端含有5'GATC悬突，另一端含有平末端（Laughery等人，2015；Laughery和Wyrick，2019）。这允许将用户定义的20-mer引导序列快速且特异地整合到选定的sgRNA表达载体中。此外这些载体可以被设计为允许在非选择性生长和影印培养（PML107，它是一种具有LEU2选择性标记的Cas9/sgRNA载体）或通过在含有5-氟乳清酸（5-FOA）的平板上进行反选（PML 104，它是具有URA3选择性标记的Cas9/sgRNA质粒）后快速去除Cas9（Laughery等人，2015年；Laughery和Wyrick，2019年）。其他克隆策略包括使用Golden gate组装将引导序列引入表达盒（DiCarlo等人，2013；Bao等人，2015）或PCR扩增，然后进行产物环化和尿嘧啶特异性切除反应（USER），将新的20-mer sgRNA序列引入表达载体（Bitinaite等人，2007；Jakočiūnas等人，2015年）。第二种方法是有用的，因为它适用于CRISPR/Cas9的多路复用实验。最后，一些小组直接转化PCR产物以生成gRNA盒（Horwitz等人，2015），甚至合成并克隆了包含sgRNA盒的整个基因块，以获得单独的指导序列。
使用Cas12a进行基因组编辑与Cas9在酵母中进行基因组编辑有许多不同之处：首先，它不需要tracrRNA，因此它们的sgRNA比Cas9更短；其次，它可以处理来自单个crRNA阵列的多个crRNA，而Cas9必须单独表达crRNA或使用额外的酶处理gRNA；第三，其PAM基序位于靶DNA序列的5'端，而Cas9位于3'端；最后，Cas12a产生交错的或粘末端DSB，通常导致缺失和点突变。与需要多个甚至复杂表达式构造的Cas9相比，Cas12a的这些财产使得多路复用实验相对简单。用Cas9处理PAM限制的另一种方法是使用其他细菌物种的Cas9（Okada等人，2021）（表2）。
