本文翻译自High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences Yao-Guang Liu and Yuanling Chen South China Agricultural University, Guangzhou, China BioTechniques 43:649-656 (November 2007) doi 10.2144/000112601
AD：简并
名词解释：
二元载体：由两个分别含有 T-DNA 和 Vir 区的相容性突变 Ti 质粒构成的双质粒系统。其中一个质粒包含外源基因，而另一个质粒则负责提供其他必要的元件，例如启动子、转录因子、融合标签等，以支持外源基因的高效表达。
摘要
获得已知序列两侧的未知DNA序列是分子生物学研究中的一项重要任务。热不对称交错PCR（TAIL-PCR）是一种有效的方法。然而，如果需要获得更大目标片段，旧的TAIL-PCR方法的成功率需要提高。本文介绍了一种经过改进的TAIL-PCR方法，该方法具有特殊的引物设计和优化后的温度条件。这种高效的TAIL-PCR（hiTAIL-PCR）结合了TAIL循环和抑制PCR的优点，因此它可以阻断非靶标产物的扩增并抑制小靶标产物，可以有效扩增更长的靶标序列。使用这种方法，在我们的测试中，反应的成功率高于90%，在大多数情况下，获得的主要产物的大小为1-3 kb。
前言
通过T-DNA和转座子插入进行DNA标记已成为研究植物功能基因组学的重要方法。使用这种方法在拟南芥和水稻中引入了大量的DNA插入系和重要的突变。但标记的基因序列不能简单地通过常规PCR程序获得，因为基因组侧翼序列是未知的。
目前为止，开发了的方法有：反向PCR、衔接子连接介导的PCR和热不对称交错（TAIL）-PCR，用于扩增两侧为已知序列的未知DNA片段。TAIL-PCR是一种仅限PCR的方法，因此特别适合手动或自动化操作大量样本。TAIL-PCR及其改良程序具有简单高效的优点，已广泛应用于多种生物的研究中，包括大规模测定拟南芥和水稻中的T-DNA和转座子插入位点，以及已知编码序列的上游（启动子）和下游序列的分离。
TAIL-PCR使用嵌套已知序列特异性引物（Tm>65°C），以及64–256倍简并度的短（15–16个核苷酸）任意简并（AD）引物（Tm约为45°C），利用热反应温度控制目标和非目标产物的相对扩增效率。在原始的TAIL-PCR中，进行一个低严格性PCR循环以产生沿着靶序列的AD引物的一个或多个退火位点。然后通过将两个高严格性PCR循环与具有降低的严格性（TAIL循环）的循环交换，优先扩增靶产物而不是仅由AD引物引发的非靶产物。
这是由于在具有高退火温度（65°–68°C）的高严格性PCR循环中，只有具有较高熔链温度的特异性引物才能有效地退火到目标靶点。AD引物由于其较低的熔链温度而在退火时效率低得多。具有较高简并程度的AD引物，可能有更多的机会与靶序列结合。然而，这往往会产生不需要的非靶小片段。为了获得更大的靶序列，我们使用专门设计的AD引物和已知的序列特异性引物开发了一种高效的TAIL-PCR（hiTAIL-PCR）程序。
材料与方法
引物
用于高效热不对称交错PCR（hiTAIL PCR）的引物.RB-0a，RB-1a和RB-2a对具有与RB相邻的Nos终止子序列的pCAMBIA二元载体（例如pCAMBIA-1305.1）是特异性的。RB-0b，RB-1b和RB-2b特定于pCAMBIA-1300。在RB-1a（RB-1b）的序列标签中，设计了两个碱基（带下划线）以不同于AC1的3'末端，以避免在二级TAIL-PCR中在该序列标签上引发AC1，并用AC1作为测序引物对来自AC1末端的初级TAIL-PCR产物进行测序。
试剂
从转基因水稻品系制备基因组DNA（通过基于pCAMBIA1305.1和pCAMBIA1300（Cambia，Canberra，Australia）的二元载体构建体转化）
使用含有20mM MgCl 2的10×PCR缓冲液（Takara Bio，Dalian，China）的Ex Taq DNA聚合酶试剂盒进行PCR。
PCR
制备预扩增反应（20μL），每个反应含有2.0μl PCR缓冲液，dATP，dCTP，dGTP和dTTP（dNTPs）各200μM，任何一种LAD引物1.0μM（在单次反应中使用两个LAD引物，每个引物在1.0μM），0.3μMRb-0a或RB-0b，0.5U Ex Taq和20-30ng转基因水稻基因组DNA。
每个初级TAIL-PCR（25μL）含有2.5μLPCR缓冲液，每种200μMdNTP，0.3μMAc1和RB-1a（或RB-1b），0.6U Ex Taq和1μL40倍稀释的预扩增产物。
每个二级 TAIL-PCR（25μL）含有2.5μlPCR缓冲液，每种200μMdNTP，0.3μMAc1和RB-2a（或RB-2b），0.5U Ex Taq和1μl10倍稀释的初级TAILPCR产物。
必要时，将初级或次级TAIL PCR放大至50μL。使用PCT-100 PCR循环仪（MJ Research，Waltham，MA，USA）以表1中所示的热条件进行PCR。在1.0%琼脂糖凝胶上分析扩增产物，从凝胶中回收单个片段，并使用DNA纯化试剂盒纯化。
结果与讨论
为hiTAIL PCR设计了4个相对较长的33或34个核苷酸的AD（LAD）引物，其在3'末端含有4个固定核苷酸，然后在6或7个位置处具有简并核苷酸（2304或6912倍简并性））（图1）。任意的3'四碱基位点具有中等频率（平均一次256 bp）以将LAD锚定到靶序列。在引物中存在NotI限制性位点，作为在含有独特NotI位点和其他独特平末端限制性位点的质粒载体中克隆靶TAIL-PCR产物的选择。不同的LAD引物在5'端共享相同的序列（AC1），通过Tm=69.3+41×GC%-650/L（L=引物长度）计算Tm为52℃。由于包括其3'末端的LAD引物的序列是任意设计的，并且特别是四碱基位点不会对特定的生物体基因组形成特异性，所以LAD引物普遍适用于各种生物体。为了从用pCAMBIA二元载体转化的转基因植物中分离T-DNA插入侧翼序列，嵌套特异性引物组（RB-0a/RB-1a/RB-2a，RB-0b/RB-1b/RB-2b）具有Tm>根据与T-DNA右边界（RB）相邻的序列设计68℃（图1）。为了产生抑制-PCR效应，在用于初级TAIL-PCR的RB-1a（RB-1b）中，与LAD引物的5'一半相同（除了两个碱基）的另外的序列（21个核苷酸）被标记到5'末端。作为比较，制备没有该序列标签的特异性引物（RB-1ac）用于初级TAIL-PCR。RB-1a和RB-2a（或RB-1b和RB-2b）之间的距离设置为88 bp（或74 bp），以便在必要时通过琼脂糖凝胶上的位移差异来确认产物特异性。
hiTAIL-PCR的效率
hiTAIL PCR程序用于从转基因水稻品系中分离T-DNA插入侧翼序列。我们首先测试了在hiTAIL PCR中使用单个LAD引物的效率。选择具有单个T-DNA插入的用pCAMBIA1305.1转化的6个品系和具有pCAMBIA1300的9个品系与四种LAD引物组合用于测试。预扩增反应产生涂片带（图2A），其含有来自水稻基因组DNA的大量随机扩增产物。在一些情况下，在琼脂糖凝胶上检测不到预扩增产物（数据未显示），但可以在初级TAIL-PCR中获得靶产物。在大多数hiTAIL PCR中，获得的主要目标产物大小约为1-3 kb，没有产生小于约0.5 kb的产物（图2，B-D），而原始和改良的TAIL-PCR程序通常产生约0.2-1.5 kb的片段。相比之下，没有抑制PCR效应的对照反应产生一些较小的产物（图2B）。在60个反应中，有56个产生了目标产物，平均成功率为93.3%，远高于原始TAIL-PCR程序的成功率（50%–70%）。所有四种LAD引物在我们的测试中都表现良好。大多数初级TAIL-PCR反应产生可检测的靶产物。因此，通常可以省略二级TAIL-PCR。在少数情况下，初级TAIL-PCR产物水平相对较低（数据未显示）；然而，它们可以在次级TAIL-PCR中扩增至高浓度。
我们还在预扩增反应中使用LAD引物库LAD1-1/LAD1-3和LAD1-3/LAD1-4来测试扩增效率是否可以进一步提高。结果表明，测试的38个反应中有37个（97.4%）成功生产了目标产物。使用合并的LAD引物的反应平均产生2.5个产物，而使用单个LAD引物的反应平均产生1.8个产物。产物的大小与使用单一LAD引物获得的大小相似或稍小，但小于约0.5kb的那些被有效阻断（图2D）。因此，在hiTAIL PCR的应用中使用LAD引物库是一个不错的选择。
如原始TAIL-PCR中所述，琼脂糖凝胶上一级和二级产物之间的差异转移（图2，C和D）是产物特异性的良好指标。在某些情况下，还通过单独的RB-1a（RB-1b）或RB-2a（RB-2b）和单独的AC1的对照（一级或二级）反应测试了特异性，其不产生可检测的产物（数据不是示出）。我们进一步纯化了几种主要的hiTAIL PCR产物用于直接测序。结果显示，所有测序产物均含有插入的T-DNA及其水稻基因组的侧翼基因组序列（图3）。
