前情提要：Red recombination system和FLP/FLT system的介绍
在大肠杆菌中，线性DNA片段很难转化成功是由于大肠杆菌能够降解线性dsDNA。为了在大肠杆菌里做到基因敲除就需要两个关键点，1.抑制线性dsDNA的降解，2.完成同源重组。
能做到这一点的，当然离不开 噬菌体。
从λ噬菌体中获得三种蛋白分别是：
1. Gam蛋白 避免进入大肠杆菌细胞内的外源线性DNA片段被降解掉。
2. Exo核酸外切酶 使外源dsDNA两端产生一段单链缺口。
3. Beta蛋白 可以结合在dsDNA两端缺口处，促进外源dsDNA片段与基因组靶标位置的同源序列发生退火配对。
在解决了敲除的问题，随之带来了一个新的问题，就是在筛选基因敲除菌株的时候，我们是用到了抗性压力筛选的。为了消除被敲除菌株的抗性（不然一个抗性只能用一次，多敲几个基因抗性都不够用了）需要使用到FLP/FRT Recombination技术。
FLP-FRT Recombination，本质上是一种位点特异性的同源重组系统（Site-directed-recombination）。转入敲除成功菌株的Pcp20质粒表达The Recombinase flippase(FLP)，识别基因组上两个序列相同的flippase recognition sites(FRT)，从而把抗性片段切除，在基因组上留下一个FRT位点，敲除菌株失去抗性，成为无抗性的敲除菌株。
因此想要完成Red基因敲除需要以下质粒：
pKD46：用于表达Red系统重组酶
pKD13：用于提供卡那霉素抗性重组模板和反转酶识别位点FRT
pKD4：用于提供卡那霉素抗性重组模板和反转酶识别位点FRT
pKD3：用于提供氯霉素抗性重组模板和反转酶识别位点FRT
pCP20：用于表达FLP重组酶识别FRT消除抗性
注：pKD46和pCP20使必须的，pKD3、pKD4和pKD13三选一。
pKD46载体用途：基因敲除载体
启动子：araBAD promoter
复制子：pSC101
载体大小：6329 bp
原核抗性：Amp+
培养温度：30℃
质粒拷贝数（Copy number）：低
pKD46是目前应用最广泛的Red同源重组基因敲除载体，含有低拷贝温度敏感型的复制子oriR101，在30℃时培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失，便于质粒的消除。该质粒还含有受阿拉伯糖（araB）启动子调控的exo、bet、gam基因，它们通过L-阿拉伯糖诱导表达，并携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记。
pKD3载体用途：基因敲除载体
启动子：Cat promoter
复制子：R6K
载体大小：2804 bp
原核抗性：Amp+、Chl+
培养温度：37℃
质粒拷贝数（Copy number）：低
5' 测序引物：R6K-3
3' 测序引物：rrnB-T1-term-F
pCP20载体用途：
大肠杆菌FLP重组酶表达质粒
复制子:pSC101
质粒大小:9332bp
原核抗性:Amp,Chl
培养条件:30度
5'测序引物:
FLP-R（GAGCTTTGTTGTAGGTGGACC）
3'测序引物:
FLP-F（TTGATGCGCTGGCAGTGTTC）
实验步骤如下：
第一步：敲除片段的获得
使用通用引物以pKD3、pKD4或pKD13为模板扩增出 反转酶识别位点FRT+抗性基因表达元件+反转酶识别位点FRT
通用引物如下：
P1:5'-ATATGAATATCCTCCTTAG-3'
P2:5'-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3 '
在获得了FRT+抗性基因表达元件+ FRT这段序列后。
在上下游引物的两端加入靶标基因CDS两侧50bp左右的同源臂。使用PCR的方式连接到 FRT+抗性基因表达元件+ FRT 的两端。
这样就获得了 上游同源臂+ FRT+抗性基因表达元件+ FRT+下游同源臂（敲除片段）
第二步：获得含有pKD46质粒的待敲除的菌株
可以使用热激法或者电转化法转化至待敲除的菌株。
第三步：含有pKD46质粒的待敲除的菌株感受态的制备
为了使λ噬菌体中获得三种蛋白在大肠杆菌里能够正常表达，首先需要把PKD46质粒先转入想要做敲除的菌株中。
1.活化。携带pKD46的甘油管菌株在固体平板上30℃过夜培养，挑取单菌落到液体LB培养基中摇瓶培养。
2. 30℃培养至OD600为0.2，加入0.2%-0.5% L-阿拉伯糖，诱导2h左右，等到OD600达到0.4-0.5，收集菌体。
3.在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液。
4.离心管中加入少量灭菌后10%甘油，轻柔的悬浮沉淀后，4℃，3000 rpm离心10min。
5.小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。
6.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按100μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。（感受态现配现用）
第四步：电转上游同源臂+ FRT+抗性基因表达元件+ FRT+下游同源臂（敲除片段）
1.将敲除片段和pKD46质粒的待敲除的菌株A感受态混匀，置于电转杯中，电压2.1KV电击。
2.电击完成后，迅速加入1ml含有0.2%-0.5% L-阿拉伯糖的LB液体培养基，混匀后转移到15ml摇菌管中（当然摇瓶也可以），置于30°培养箱中过夜培养（目的是pKD46诱导表达，完成基因敲除和抗性基因的重组），取适当体积涂布于抗性平板上，置于37°培养（消除pKD46质粒）。
第五步：基因敲除菌株的鉴定
选择在同源交换位点上下游100bp处设计引物，以未敲除的菌株作为对照，比较敲除菌株PCR产物的大小后，将敲除菌株PCR产物送公司测序。
第六步：消除敲除菌株的抗性基因。
1.完成敲除菌株的感受态制备。
2.把pCP20转化至完成敲除菌株。
3.30℃培养过夜含有pCP20的敲除菌株后，转为42°培养，消除pCP20，取适当菌液涂于抗性平板验证抗性是否消除。
