前情提要：Gateway克隆方法 源于 λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应。
有时会见到相关载体骨架中含有ccdB基因，这是自杀基因。ccdB基因的表达产物能抑制普通E.coli生长,在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化后不能生长。
比如说这个质粒：CmR后就有ccdB。
CmR基因是氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol Acetyltransferase ，CAT）是一种原核酶类，可以将氯霉素乙酰化而使其失活，是细菌产生氯霉素抗性的主要原因。
入门克隆
入门克隆是你开始实验的起点，它包含目的基因，两侧是attL序列（用来与attR序列重组）
一旦入门克隆准备好了，目的基因就可以很容易地转移到目的载体上。这个反应是由LR Clonase酶混合物介导的，它可以将入门克隆中目的基因整合到目的地载体中。
逆转这一反应很简单：它需要使用BP Clonase酶制剂进行BP反应（attB和attP位点之间的重组）。
而构建入门克隆就是利用了BP反应。
BP反应发生在连接插入片段的attB位点和供体载体上的attP。
而入门克隆上含有的attL位点连接的插入片段，而ccdB基因从donor载体上切除，两侧连接有attR位点。
选择目的地载体
Gateway技术有助于通过位点特异性重组将基因克隆到多个载体中和从多个载体中克隆出来。一旦一个基因被克隆到入门克隆中，你就可以同时将DNA片段移动到一个或多个目的载体中。
建立Entry克隆的策略
三种构建入门克隆的方法：
（A）BP克隆：BP 反应发生在插入物侧面的 attB 位点和供体载体的 attP 位点之间，BP 克隆酶负责将 DNA 序列从起始载体（Entry Vector）克隆到中间载体（Destination Vector），并产生含有侧翼为 attL 位点的目的 DNA 作为入门载体。
目前来说最常用，最稳妥的是BP克隆。
（B）TOPO®克隆：TOPO®克隆（基于拓扑异构酶的克隆技术）不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法。该技术依赖于互补的碱基对腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的基本能力来杂交并形成氢键。
（C）限制性酶和连接酶的克隆。
多位点Gateway
可以轻松而准确地按照你所希望的顺序和方向组装多个DNA片段。
1. 用含有特定attB的PCR引物扩增你目的基因。
2. 通过Gateway BP重组，用attB侧翼的PCR片段和适当的载体构建入门克隆。
3. 将进入克隆与有attR1和attR2位点的载体重组，生成一个表达质粒。
序列
attB1
acaagtttGTACAAAAAAGCAGGCT
attB2
ACCCAGCTTTcttgtacaaagtggt
attR1
acaagtttgtacaaaaaagctgaacgagaaacgtaaaatgatataaatatcaatatattaaattagattttgcataaaaaacagactacataatactgtaaaacacaacatatccagtcactatg
attR2
catagtgactggatatgttgtgttttacagtattatgtagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgtttctcgttcagctttcttgtacaaagtggt
attL1
CAAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
attL2
ACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTG
CmR
atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaa
ccdB
atgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataa
一些题外话：
噬菌体真是为科研贡献了不少方法，发挥了许多重要的作用，真的是光是噬菌体就能写一部噬菌体的前世今生了。
噬菌体被广泛用作基因工程和基因转移的工具。利用噬菌体的寄生性和病毒性，可以将外源DNA导入宿主细胞中并进行表达，从而实现基因转移和功能研究。
噬菌体的病毒学特性被广泛用于研究病毒感染和免疫应答。研究者可以利用噬菌体模拟病毒感染的过程，分析宿主细胞的免疫应答和病毒复制机制。
噬菌体可以用于研究细胞生物学和分子生物学中的一些基本问题，例如基因调控、DNA复制和修复等。此外，噬菌体的寄生性和复制机制也为细胞周期等方面的研究提供了有用的模型。
噬菌体还可以用于研究抗生素和抗病毒药物的发现和开发。利用噬菌体的寄生性和病毒性，可以筛选出具有杀菌或抑制病毒复制功能的化合物，并进一步优化和开发成药物。
