AD：简并
二元载体：由两个分别含有 T-DNA 和 Vir 区的相容性突变 Ti 质粒构成的双质粒系统。其中一个质粒包含外源基因，而另一个质粒则负责提供其他必要的元件，例如启动子、转录因子、融合标签等，以支持外源基因的高效表达。
什么是hiTAIL-PCR
热不对称交错PCR（TAIL-PCR）是一种有效获得已知序列两侧的未知DNA序列方法。
hiTAIL-PCR结合了TAIL循环和抑制PCR的优点，因此它可以阻断非靶标产物的扩增并抑制小靶标产物，可以有效扩增更长的靶标序列。使用这种方法，反应的成功率高于90%，在大多数情况下，获得的主要产物的大小为1-3 kb。
探索基因组侧翼序列的方法有哪些?
反向PCR
衔接子连接介导的PCR
热不对称交错（TAIL）-PCR，用于扩增两侧为已知序列的未知DNA片段。TAIL-PCR是一种仅限PCR的方法，因此特别适合手动或自动化操作大量样本。TAIL-PCR使用嵌套已知序列特异性引物（Tm>65°C），以及64–256倍简并度的短（15–16个核苷酸）任意简并（AD）引物（Tm约为45°C），利用热反应温度控制目标和非目标产物的相对扩增效率。
在原始的TAIL-PCR中，进行一个低严格性PCR循环以产生沿着靶序列的AD引物的一个或多个退火位点。然后通过将两个高严格性PCR循环与具有降低的严格性（TAIL循环）的循环交换，优先扩增靶产物而不是仅由AD引物引发的非靶产物。这是由于在具有高退火温度（65°–68°C）的高严格性PCR循环中，只有具有较高熔链温度的特异性引物才能有效地退火到目标靶点。
hiTAIL-PCR 程序
图 1 . 用于高效热不对称交错PCR（hiTAIL PCR）的引物。RB-0a，RB-1a和RB-2a对具有与RB相邻的Nos终止子序列的pCAMBIA二元载体（例如pCAMBIA-1305.1）是特异性的。RB-0b，RB-1b和RB-2b特定于pCAMBIA-1300。在RB-1a（RB-1b）的序列标签中，设计了两个碱基（带下划线）以不同于AC1的3'末端，以避免在二级TAIL-PCR中在该序列标签上引发AC1，并用AC1作为测序引物对来自AC1末端的初级TAIL-PCR产物进行测序。
PCR程序设置
Ex Taq DNA聚合酶试剂盒：20mM MgCl 2的10×PCR缓冲液（Takara Bio）
制备预扩增反应（20μL），每个反应含有2.0μl PCR缓冲液，dATP，dCTP，dGTP和dTTP（dNTPs）各200μM，任何一种LAD引物1.0μM（在单次反应中使用两个LAD引物，每个引物在1.0μM），0.3μMRb-0a或RB-0b，0.5U Ex Taq和20-30ng目的基因组DNA。
每个初级TAIL-PCR（25μL）含有2.5μLPCR缓冲液，每种200μMdNTP，0.3μMAc1和RB-1a（或RB-1b），0.6U Ex Taq和1μL40倍稀释的预扩增产物。
每个二级 TAIL-PCR（25μL）含有2.5μlPCR缓冲液，每种200μMdNTP，0.3μMAc1和RB-2a（或RB-2b），0.5U Ex Taq和1μl10倍稀释的初级TAILPCR产物。
必要时，将初级或次级TAIL PCR放大至50μL。使用PCT-100 PCR循环仪（MJ Research，Waltham，MA，USA）以表1中所示的热条件进行PCR。在1.0%琼脂糖凝胶上分析扩增产物，从凝胶中回收单个片段，并使用DNA纯化试剂盒纯化。
hiTAIL PCR相对较长的33或34个核苷酸的AD（LAD）引物，其在3'末端含有4个固定核苷酸，然后在6或7个位置处具有简并核苷酸（2304或6912倍简并性））（图1）。
任意的3'四碱基位点具有中等频率（平均一次256 bp）以将LAD锚定到靶序列。在引物中存在NotI限制性位点，作为在含有独特NotI位点和其他独特平末端限制性位点的质粒载体中克隆靶TAIL-PCR产物的选择。
不同的LAD引物在5'端共享相同的序列（AC1），通过Tm=69.3+41×GC%-650/L（L=引物长度）计算Tm为52℃。由于包括其3'末端的LAD引物的序列是任意设计的，并且特别是四碱基位点不会对特定的生物体基因组形成特异性，所以LAD引物普遍适用于各种生物体。
hiTAIL-PCR的效率
在60个反应中，有56个产生了目标产物，平均成功率为93.3%，远高于原始TAIL-PCR程序的成功率（50%–70%）。
大多数初级TAIL-PCR反应产生可检测的靶产物。因此，通常可以省略二级TAIL-PCR。在少数情况下，初级TAIL-PCR产物水平相对较低（数据未显示）；然而，它们可以在次级TAIL-PCR中扩增至高浓度。
[1] Liu Y G , Chen Y .High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J].BioTechniques, 2007(5):43.
引物中除ATCG以外字母的含义
IUB标准兼并碱基代码
M:(A/C) V:(A/C/G)
R:(A/G) H:(A/C/T)
W:(A/T) D:(A/G/T)
S:(C/G) B:(C/G/T)
Y:(C/T) N:(A/G/C/T)
K:(G/T)
修饰
