Overview
pCambia载体骨架来源于pPZP载体。
pCambia载体中的植物选择基因由双增强子版本的CaMV35S启动子驱动，并由CaMV35S-polyA信号终止。报告基因在C末端具有六个组氨酸标签，从而能够在固定化金属亲和层析树脂上进行简单纯化。
储存和稳定性
重新悬浮后，将载体的所有样品储存在–20°C或更低的温度下。
质量控制
植物表达载体已通过限制性内切酶消化鉴定，一些通过在培养中使用合适的农杆菌菌株转化为拟南芥植物物种进一步鉴定，并验证其活性。
pCambia的命名
四位编号系统的工作原理如下：第一位-表示工厂选择：0表示不存在；1用于潮霉素抗性；2用于卡那霉素；第二位数字-表示细菌选择：1表示大观霉素/链霉素耐药性；氯霉素2个；卡那霉素3个；第三位-表示使用的聚链器：0表示pUC18聚链器；pUC8聚链体为8；9用于pUC9聚链。
第四位-表示存在报告基因：0表示无报告基因；1个用于大肠杆菌gusA；2用于mgfp5；3用于gusA:mgfp5融合；4用于mgfp5：gusA融合；5，用于葡萄球菌gusA（GUSPlus）。
第五位-注意其他一些特殊功能。到目前为止，这只用于pCAMBIA1305.1及其衍生的质粒，其中.1表示GUSPlus缺乏信号肽™ 蛋白质和pCAMBIA1305.2，其中.2表示用于GUSPlus的植物内分泌的GRP信号肽的存在™ 蛋白质
滞后字母-Z表示用于蓝白筛选的功能性lacZa的存在。
将外源基因克隆到pCambia载体中
在一些载体中使用了pUC18多联体，但也使用了pUC8和pUC9多联体来简化克隆酶的选择。
有了聚合酶链式反应的手段，不再需要有大量的克隆位点。较小的多链接器还消除了SphI(具有ATG)或XbaI(具有标记)等站点的潜在冲突。这使得载体中的其他站点更有用(例如T-DNA右边界外的SphI站点，或T-DNA左边界外的SacII站点)。
PCambia载体中的植物选择基因由CaMV35S启动子的双增强子版本驱动，并由CaMV35S Polya信号终止。
该35S启动子可以对同一盒中其他基因的表达具有增强子作用，因此使用pCambia衍生物的基因表达结果（其中该启动子的部分仍然存在）应谨慎解释。
报告基因在C末端具有六组氨酸标签，从而能够在固定化金属亲和层析树脂上进行简单纯化。该标签的序列出现在第一个NheI位点（在pVS1 rep中有第二个NheI位点，我们没有消除）和唯一的PmlI位点之间。可以插入感兴趣的基因来代替报告基因。在（第一个）NheI位点没有终止密码子和框架的插入将在您感兴趣的蛋白质上附加六组氨酸标签。在没有终止密码子的情况下插入并且在PmlI位点的框架中插入将附加终止密码子。
在BstEII位点插入既不会添加标签也不会添加终止密码子（因此您可能需要确保此处插入的序列包含终止密码子）。
使用植物表达载体
转化pCambia系列表达载体
如果您希望繁殖和维护载体，我们建议使用根癌农杆菌或大肠杆菌进行转化。
重组前需要考虑的事项
你的插入物应该包含一个带有ATG起始密码子的Kozak共有序列，以便正确启动翻译。如果你想包括V5表位和6xHis标签，你的基因在进入克隆中不应该包含终止密码子。该基因还应被设计为在重组后与C末端表位标签处于同一框架中。
如果您不希望包含V5表位和6xHis标签，请确保您的基因在进入克隆中包含终止密码子。
转染
介绍
本节提供了将表达克隆转染到所选植物中的一般信息。我们建议您在实验中加入阳性对照载体和模拟转染（阴性对照），以评估您的结果。
根癌土壤杆菌感受态细胞的制备：
7.2.1用750µL根癌农杆菌（例如GV3101:：pMP90）接种250 mL LB培养基。
7.2.2在28°C（Dubenoff摇动水浴）下剧烈摇动培养11小时，直到OD约为0.75。
7.2.3通过离心（5000rpm）将细胞沉淀。
7.2.4用2 mL无菌TE清洗沉淀。
7.2.5在室温下以5000rpm离心10分钟。
7.2.6在20 mL LB培养基中重新悬浮沉淀。将250µL该悬浮液等分放入1.5 mL微量离心管中。
根癌土壤杆菌细胞的转化和回收：
7.3.1将20µL的载体（5µg）加入上述LB培养基中的感受态GV3101:：pMP90根癌农杆菌样品（250µL）中。
7.3.2在冰上（0°C）培养5分钟。
pCambia植物表达载体7 7.3.3在液氮（-80°C）中培养5分钟。
7.3.4在37℃（水浴）下培养5分钟。
7.3.5向每个小瓶中加入LB培养基（1 mL），并在室温下（旋转）孵育4小时。
7.3.6将细菌划线到含有适当选择抗生素的LB琼脂平板上，并在28°C下孵育3天。
7.3.7挑选一个菌落，在含有适当选择抗生素的LB琼脂平板上重新划线，并在28°C下孵育2天
花器官浸蘸法转化
7.4.1制备渗透介质（250 mL）（见附录中的配方）。
7.4.2制备用于植物生长的MS琼脂凝胶（见附录中的配方）。
7.4.3将15–20 mL移液管放入25 x 250 mm无菌试管中，用于浸泡后生长的每株植物。
7.4.4在含有适当选择抗生素（2 mL）的LB培养基中，在28°C（Dubenoff摇动水浴）下，剧烈摇动，培养一个转化细菌菌落（见上文第5.3.7步）过夜。
7.4.5用1.25 mL来自上述步骤4的预培养物接种225 mL LB培养基。在28°C（Dubenoff摇动水浴）下剧烈摇动培养过夜。
7.4.6通过在25摄氏度下以6000转/分的速度离心10分钟，将细菌制成颗粒。
7.4.7在渗透培养基（50 mL）中重新悬浮细菌，并旋转以确保细菌完全混合。
7.4.8将细菌悬浮液转移到无菌浸渍盒中（移液管尖端盒的盖子工作良好）。这个过程最好在无菌条件下的层流罩中进行。
阳性对照：
我们建议使用阳性对照载体进行植物转染和表达，该载体可用于优化特定植物中的重组蛋白表达水平。
可以通过蛋白质印迹或功能测定检测的C末端标记的β葡萄糖醛酸酶融合蛋白的表达载体提供了测量蛋白质表达水平的最简单方法。
维持质粒：
7.6.1将载体重新浸泡在20µL无菌水中，制备1µg/µL储备溶液，并在-20°C下储存。使用储备溶液转化根癌农杆菌，或等效载体。
7.6.2在含有适当选择抗生素的LB琼脂平板上选择转化体。
7.6.3制备含有质粒的转化体的甘油储备，用于长期储存。用移液管将15-20 mL移到25 x 250 mm的无菌试管中，用于浸泡后生长的每株植物。
表达与分析
从表达克隆中表达您感兴趣的基因可以在瞬时转染的细胞或稳定的细胞系中进行。
8.1使用细胞裂解物的GUS测定来自上述步骤的细胞裂解物可以使用β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因活性检测试剂盒ab253372测定GUS活性。
8.2检测重组融合蛋白：为了通过蛋白质印迹分析检测重组融合蛋白质的表达，您可以使用抗-V5抗体或抗His（C项）抗体或针对您感兴趣的蛋白质的抗体。
8.3使用细胞裂解物的GUS测定如果您使用阳性对照载体，您可以使用无细胞裂解物通过蛋白质印迹分析或活性测定来测定β葡萄糖醛酸酶的表达。X-GlcU染色或荧光检测是常见的分析方法。
8.4重组融合蛋白的纯化：重组融合蛋白中存在C末端多组氨酸（6xHis）标签，可以使用金属螯合树脂进行纯化。
附录
1.LB（Luria Bertani）培养基和培养板组成：1.0%胰蛋白酶0.5%酵母提取物1.0%NaCl pH 7.0 1。对于1升，将10克胰蛋白酶、5克酵母提取物和10克NaCl溶解在950毫升去离子水中。
2.用NaOH将溶液的pH调节至7.0，并将体积增加至1升。
3.在15磅/平方英寸的压力下进行20分钟的液体循环高压灭菌器。将溶液冷却至55°C，必要时添加抗生素。在室温或+4°C下储存。
LB琼脂平板：1。如上所述制备LB培养基，但在高压灭菌前加入15g/L琼脂。
2.在15磅/平方英寸的压力下进行20分钟的液体循环高压灭菌器。
3.高压灭菌后，冷却至~55°C，如果需要，添加抗生素，倒入10厘米的盘子中。
4.使其硬化，然后倒置并储存在+4°C下。
4X SDS-PAGE样品缓冲液：1。合并以下试剂：0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，5 mL甘油（100%），4 mLβ-巯基乙醇，0.8 mL溴酚蓝，0.04 g十二烷基硫酸钠，0.8 g 2。用无菌水将体积调至10毫升。
3.等分并在-20°C下冷冻，直到需要为止。
渗透介质：½MS盐（MS盐：1650.00mg/L硝酸铵、332.02mg/L无水氯化钙、180.70mg/L无水硫酸镁、1900.00mg/L硝酸钾、170.00mg/L磷酸二氢钾、6.20mg/L硼酸、0.025mg/L氯化钴·6H20、0.025mg/L硫酸铜·5H20、37.26mg/L Na2-EDTA、16.90mg/L硫酸锰-H20、0.250mg/L钼酸钠盐、0.83mg/L钾m碘化物、27.80 mg/L硫酸亚铁·7H20、8.60 mg/L硫酸锌·7H2O）1X甘伯格B5维生素5%蔗糖（w/v）0.044µm 6-苄氨基嘌呤（BAP）（储备溶液1mg/mL DMSO）0.05%Silwet L77（Lehle Seeds）对于250 mL渗透培养基，混合12.5 mL 10X MS盐、0.25 mL甘伯格B5维他命1000X、12.5 mg蔗糖、2.5µL 1 mg/mL苄氨基嘌呤储备溶液，12.5µL Silwet L77224.73 mL dH20。储存温度为+4°C。
MS琼脂植物生长培养基：1。将10.6 g Murashige&Skoog（MS）培养基和250 mL dH20在15磅/平方英寸的液体循环中高压灭菌20分钟。
