亮点论文 | 甘薯激酶基因IbHT1的克隆及抗旱性功能鉴定

学术三农 2024-10-23 08:26 北京

王语新陈天羽翟红张欢高少培何绍贞赵宁刘庆昌^*

农业农村部甘薯生物学与生物技术重点实验室/中国农业大学农学院, 北京100193

摘要 Abstract

HT1 (HIGH LEAF TEMPERATURE 1)属于蛋白激酶，在模式植物拟南芥中主要参与气孔运动，但其在甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam.)中的作用未见相关报道。本研究从甘薯品系徐薯55-2中克隆得到IbHT1基因，其CDS全长1140 bp，编码379个氨基酸。IbHT1蛋白具有一个保守的STKc_MAP3K_Like蛋白激酶结构域，预测分子量大小43.07 kD，等电点8.83。其基因组全长2796 bp，含有3个外显子和2个内含子。IbHT1蛋白定位于细胞膜上，其蛋白全长无转录激活活性。IbHT1基因受20% PEG-6000诱导下调表达。过表达IbHT1基因减弱了甘薯植株的抗旱性，而RNA干扰该基因显著增强了甘薯植株的抗旱性。通过酵母筛库筛选到与IbHT1蛋白互作的10个蛋白，由此推测，IbHT1蛋白激酶可能通过与这些蛋白相互作用从而共同参与甘薯抗旱性的调控。

同行专家评语

该研究从甘薯品中克隆得到IbHT1基因，对其进行了基本的生物信息学分析。后续作者通过稳定的遗传转化实验获得了过表达和RNAi转基因植株，进一步的抗性测试结果表明其在甘薯的抗旱进程中发挥着负调控作用；通过酵母筛库筛选到与IbHT1蛋白互作的10个蛋白，由此推测，IbHT1蛋白激酶通过与其互作蛋白之间相互作用从而负调控甘薯的抗旱性。该研究初步鉴定了IbHT1的功能，并为今后进一步阐明IbHT1在甘薯中的功能和分子调控机制奠定了基础，是一个不错的研究工作。

植物在生长发育过程中面临着诸多的非生物胁迫，包括干旱、盐碱和极端温度等，不利的环境严重影响植物的生长发育[1-2]。干旱是影响植物生长发育的主要非生物胁迫之一，水资源匮乏加剧了土壤干旱，植物生长受到巨大威胁[3]。当植物受到干旱胁迫时，多种干旱相关基因协同发挥作用。其中，蛋白激酶作为一类重要的蛋白，在调控植物干旱胁迫响应中发挥重要作用[4]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联在调节植物生长、发育以及胁迫反应中具有重要作用[5]。MAPK形成严格控制的信号级联从而行使功能。MAPK级联途径由3个组分组成，包括MAPKKK (MAP3K)、MAPKK (MKK)和MAPK (MPK)，是一类重要的信号转导途径，参与生物或非生物的胁迫反应、激素反应、细胞分裂和发育过程的信号转导等[6-7]。MAPK家族基因在植物抗旱中的功能已经有了诸多报道。例如，在拟南芥中，MAPKKK18通过下游MAPKK3提高植株的抗旱性[8]。在水稻中，OsDSM1和OsMKK10.2正调控植株的抗旱性[9-10]。在玉米中，ZmMPK6磷酸化ZmWRKY104正调控植株的抗旱性[11]。在棉花中，GhMAP3K15-GhMKK4-GhMPK6-GhWRKY59 -GhDREB2模块参与调控植株的抗旱性[12]。辣椒MAPK基因CaAIMK1过表达后通过ABA途径提高植株的抗旱性[13]。

HT1蛋白激酶具有一个保守的STKc_MAP3K_like结构域，属于MAPKKK蛋白激酶[14]。在拟南芥中，HT1参与CO2响应的气孔运动，对红光诱导的气孔打开至关重要，并能够与ABA信号途径中关键蛋白激酶气孔开放因子1 (stomatal opening factor 1, OST1)相互作用参与到气孔对红光和CO2的响应中[15-16]；其能够通过与MPK12和GHR1共同参与调控离子通道蛋白SLAC1来调节气孔运动，MAP4/12通过抑制HT1的激酶活性来促进气孔关闭[17-18]。

甘薯是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物，由于其产量高、营养价值丰富，在解决粮食和营养安全问题方面具有很大潜力[19]。甘薯主要种植于干旱和半干旱地区，提高其抗旱性有助于提高其产量和品质[20]。甘薯为同源六倍体，遗传背景复杂，种内及种间杂交不亲和等使得其常规育种遇到诸多困难[21-22]。基因工程已经成为改良甘薯的重要途径，近年来，甘薯的基因克隆及功能研究迅速发展，已经发掘出数个抗旱相关基因。例如，分别过表达IbCBF3、IbEGF、IbSnRK1和IbTSJT1基因提高了甘薯的抗旱性[23-26]。IbC3H18-IbPR5和IbBBX24-IbTOE3-IbPRX17模块正调控甘薯的抗旱性[27-28]。IbPYL8-IbbHLH66-IbbHLH118模块通过ABA信号途径调控甘薯的抗旱性[29]。

关于甘薯MAPK的研究已有一些报道。周桦楠等[30]利用生物信息学的方法分析了甘薯MAPK基因家族，为研究甘薯MAPK激酶提供了参考。在甘薯中过表达IbMPK6提高了植株的耐低温能力，IbMPK6通过调控低温相应相关基因IbCBF3和IbCOR27行使功能[31]。靖小菁等[32]克隆了IbMAPKK9基因，发现其响应甘薯蔓割病菌侵染。但是，甘薯MAPK家族基因的研究仍不深入，大量的MAPK基因尚未被挖掘。本研究基于本实验室前期获得的甘薯抗旱品系徐薯55-2转录组[33]，克隆得到MAPKKK蛋白激酶基因IbHT1，对其结构及特性进行了分析，并通过根癌农杆菌介导的甘薯胚性悬浮细胞遗传转化法，获得过表达和干扰IbHT1基因的甘薯植株，发现该基因负调控甘薯的抗旱性。

1 材料与方法

1.1 植物材料

甘薯抗旱品系徐薯55-2 (Xushu 55-2)的转录组已由本实验室前期完成[33]，徐薯55-2用于IbHT1基因的克隆。旱敏感甘薯品种栗子香(Lizixiang)用于遗传转化以鉴定IbHT1基因的功能。所有植物材料均由本实验室保存。

1.2 菌株与质粒

大肠杆菌感受态DH5α和DE3购自康为世纪生物科技有限公司(北京)；根癌农杆菌感受态EHA105和酵母感受态Y2HGold保存于本实验室。基因克隆载体pMD19-T购自TaKaRa (大连)；甘薯转化载体pCAMBIA1300-GFP和pFGC-5941、亚细胞定位载体pCAMBIA1300-GFP、原核表达试验载体pET-28a均保存于本实验室。

1.3 IbHT1基因的克隆与序列分析

以培养1个月的徐薯55-2试管苗的叶片为材料，使用TRIzon (康为世纪，北京)提取总RNA，然后将约1 μg的总RNA使用HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix试剂盒(康为世纪，北京)进行反转录得到cDNA作为基因克隆的模板。根据徐薯55-2干旱转录组中差异表达序列，在甘薯基因组数据库(http://sweetpotato-garden.kazusa.or.jp/index. html)中检索到IbHT1的参考CDS序列，利用Primer Premier 5软件设计同源克隆引物，引物序列见表1。利用Primer Premier 5软件将获得的CDS序列翻译为蛋白质。使用NCBI网站进行保守结构域分析。使用DNAMAN软件[34]和MEGAX软件[35]进行多序列比对和系统发育分析。用Expasy ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白分子量和理论等电点(pI)。用CTAB法提取培养1个月的徐薯55-2试管苗的叶片DNA [36]，以其为模板进行PCR扩增，获得IbHT1基因组全长序列，引物序列见表1。使用Splign工具[37]确定基因组结构。

1.4 IbHT1基因的表达分析

将培养1个月的徐薯55-2的试管苗浸入含有20% PEG-6000的霍格兰溶液中进行处理，于处理后0、1、3、6、12和24 h取样；取培养1个月的徐薯55-2试管苗的根、茎、叶柄和叶，生长3个月的徐薯55-2大田植株的块根、梗根、须根、茎和叶，研磨提取RNA并进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用RT-qPCR方法和SYBR Green Master Mix试剂盒(YEASEN，上海)，分析IbHT1基因的表达。甘薯肌动蛋白基因Actin为内参基因。试验所用引物序列见表1。

1.5 IbHT1蛋白的亚细胞定位分析

为了对IbHT1蛋白进行亚细胞定位，以IbHT1基因的CDS序列为模板，删除终止密码子后，构建pCAMBIA1300-IbHT1-GFP载体。空载体pCAMBIA1300-GFP作为阴性对照。将载体瞬时转入水稻原生质体中表达16 h。使用共聚焦荧光显微镜检测激发波长为488 nm (GFP)和546 nm (mCherry)的荧光信号。

1.6 IbHT1蛋白的转录激活活性分析

为了分析IbHT1蛋白的转录激活活性，以IbHT1基因的CDS序列为模板，构建pGBKT7-IbHT1载体。空载体pGBKT7作为阴性对照，pGBKT7-53为阳性对照。将载体转入Y2HGold酵母细胞感受态中，将其培养在SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade培养基上，30℃培养观察菌落生长情况。

1.7 蛋白纯化分析

以IbHT1基因的CDS序列为模板，构建pET-28a-IbHT1载体，将该质粒转入大肠杆菌DE3中。在加入IPTG的LB培养基中16℃过夜诱导产生His-HT1重组蛋白，然后进行蛋白纯化。将纯化蛋白用Anti-His的抗体进行Western blot检测。

1.8 转基因甘薯植株的获得

以IbHT1基因的CDS序列为模板，构建过表达载体pCAMBIA1300-IbHT1-GFP。设计IbHT1基因的一对正向和反向非保守序列为模板构建RNA干扰载体pFGC5941-IbHT1。将这些融合质粒分别转化根癌农杆菌感受态EHA105，然后侵染栗子香胚性悬浮细胞团。侵染后的细胞团在含有30 mg L^-1乙酰丁香酮(AS)和2.0 mg L⁻¹2,4-D的固体MS培养基上共培养3 d，随后转移到含有2.0 mg L⁻¹ 2,4-D和100 mg L⁻¹头孢霉素(CS)的液体MS培养基中延迟培养7 d，将经过延迟培养的细胞团平铺在含有2.0 mg L⁻¹ 2,4-D、100 mg L⁻¹ CS和抗性物质(过表达，11.0 mg L⁻¹潮霉素；干扰，50 mg L⁻¹(RS)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵)的固体MS培养基上进行筛选培养4~8周，将筛选后状态良好的抗性愈伤组织转移至含有1.0 mg L⁻¹ ABA和100 mg L⁻¹ CS的固体MS培养基上进行再生培养，直至再生出完整植株[38]。获得的拟转基因植株分别在DNA水平进行PCR鉴定，在RNA水平通过RT-qPCR进行鉴定。试验所用引物序列见表1。

1.9 转基因甘薯植株的抗旱性鉴定

将转IbHT1基因甘薯植株和野生型对照植株分别在MS基本培养基(control)和含有20% PEG-6000的MS培养基上培养1个月，观察植株长势，测定植株重量。

1.10 互作蛋白的筛选

将pGBKT7-IbHT1作为诱饵载体与甘薯酵母文库共转化Y2HGold中，将其培养在SD2 (SD/-Trp/-Leu)和SD4 (SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu)培养基上，30℃培养。将SD4培养基上的阳性克隆提取酵母质粒后转入大肠杆菌DH5α后进行菌液PCR检测。阳性菌液由华大基因科技有限公司(北京)进行测序。试验所用引物序列见表1。

1.11 统计分析方法

所有试验重复3次。用*和**分别表示Student’s t测验在P < 0.05和P < 0.01水平的差异显著性，用不同小写字母表示ANOVA post-hoc Tukey’s test在P < 0.05水平的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 IbHT1基因的克隆与序列分析

从甘薯品系徐薯55-2中扩增得到IbHT1基因的CDS序列，全长1140 bp，其编码379个氨基酸(aa)，预测分子量大小43.07 kD，等电点为8.83 (图1-A)。不同物种中的HT1同源蛋白序列比对及IbHT1保守结构域分析结果显示，该蛋白包含一个保守的STKc-MAP3K-Like结构域(图1-B, C)。进化树分析显示，IbHT1与ItHT1亲缘关系最近(图1-D)。IbHT1的基因组结构与拟南芥AtHT1相似，均含有3个外显子和2个内含子(图1-E)。

图1 IbHT1基因的克隆及序列分析

A: IbHT1基因扩增产物; B: HT1蛋白序列的多重比较; C: IbHT1蛋白结构示意图; D: IbHT1蛋白进化树分析; E: IbHT1与AtHT1的基因组结构比较。

2.2 IbHT1基因受PEG-6000的诱导下调表达

RT-qPCR结果显示，IbHT1的表达受到20% PEG-6000诱导显著下调，在处理12 h时达到最低至0.16倍(图2-A)。组织特异性表达分析结果显示，IbHT1在徐薯55-2试管苗的叶柄中表达量最高，在徐薯55-2大田植株的叶中表达量最高(图2-B, C)。

图2 IbHT1基因在徐薯55-2中的表达分析

A: 在20% PEG-6000处理下IbHT1在徐薯55-2试管苗中的表达分析; B: IbHT1在徐薯55-2试管苗的根(R)、茎(S)、叶柄(P)和叶(L)中的表达分析; C: IbHT1在徐薯55-2大田植株的块根(SR)、梗根(PR)、须根(FR)、茎(S)和叶(L)中的表达分析。**表示用Student’s t测验在P < 0.01水平差异显著，不同小写字母表示用ANOVA post-hocTukey测验在P < 0.05水平差异显著。

2.3 IbHT1蛋白定位于细胞膜上

为了研究IbHT1的亚细胞定位，在水稻原生质体中瞬时表达了IbHT1-GFP融合蛋白和细胞膜定位标记融合蛋白PIP2A-mCherry。结果显示，IbHT1蛋白定位于细胞膜上(图3)。

图3 IbHT1蛋白在水稻原生质体中亚细胞定位

PIP2A-mCherry为细胞膜定位marker，标尺为20 μm。

2.4 IbHT1蛋白无转录激活活性

在酵母系统中检测IbHT1蛋白全长转录激活活性，转化pGBKT7-IbHT1的酵母细胞在SD/-Trp培养基上正常生长，但是在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上无法生长，表明IbHT1蛋白无转录激活活性(图4)。

图4 在酵母细胞中IbHT1蛋白的转录激活活性分析

2.5 IbHT1在DE3中诱导出具有相应大小的蛋白

转入pET28a-IbHT1载体的DE3诱导完成的蛋白经过Western Blot检测后得到45~65 kD蛋白，大小与预测蛋白大小相一致，表明IbHT1可以在DE3中进行原核表达(图5)。

图5 His-IbHT1纯化蛋白

2.6 转IbHT1基因甘薯植株的获得

为研究IbHT1基因在甘薯干旱胁迫响应中的功能，利用根癌农杆菌EHA105介导的甘薯胚性悬浮细胞遗传转化方法，获得11株IbHT1过表达甘薯植株(编号为OH-1~OH-11)和4株RNA干扰植株(编号为RH-1~RH-4) (图6)。

图6 转IbHT1基因甘薯植株的获得

A: 在含有2.0 mg L⁻¹2,4-D的MS液体培养基中迅速生长的栗子香胚性悬浮细胞系; B: 在含有2.0 mg L⁻¹ 2,4-D、100 mg L⁻¹头孢霉素和11.0 mg L⁻¹潮霉素(Hyg)的MS固体培养基上筛选后形成的Hyg抗性胚性愈伤组织(亮黄色); C: Hyg抗性愈伤组织在含有1.0 mg L⁻¹ABA和100 mg L⁻¹头孢霉素的MS固体培养基上再生植株; D: 在MS基本培养基上获得的完整再生植株; E, F: IbHT1转基因植株的PCR鉴定。M: DL2000 marker; W: 水(阴性对照); WT: 栗子香(阴性对照); P: 质粒(阳性对照); OH-1~OH-11: 过表达植株; RH-1~RH-4: RNA干扰植株; G, H: 在正常条件下转基因植株中IbHT1基因的表达分析。**表示用Student’s t测验在P < 0.01水平差异显著。

2.7 干扰IbHT1基因提高了甘薯的抗旱性

根据转基因甘薯植株中IbHT1的表达水平，选择2个过表达株系(OH-10和OH-11)及2个RNAi株系(RH-3和RH-4)进行了抗旱性评价。将转基因植株和野生型对照植株(WT)在含有20% PEG-6000的MS培养基上培养1个月后发现，与WT相比，过表达IbHT1基因甘薯植株的长势显著减弱，鲜重显著降低；而RNAi甘薯植株的长势显著增强，鲜重显著增加。表明干扰IbHT1基因提高了甘薯的抗旱性(图7)。

图7 转IbHT1基因甘薯植株的抗旱性鉴定

A, B: 在正常MS培养基上植株的生长情况与鲜重(对照); C, D: 在含有20% PEG-6000的MS培养基上植株的生长情况与鲜重。标尺为10 cm。*和**分别表示用Student’s t测验在P < 0.05和P < 0.01水平差异显著。WT: 野生型; OH-10和OH-11: IbHT1基因过表达株系; RH-3和RH-4: IbHT1基因RNA干扰株系。

2.8 IbHT1拟互作蛋白的筛选

为了研究IbHT1基因调控甘薯抗旱性的分子机制，以pGBKT7-IbHT1作为诱饵载体对甘薯酵母双杂交文库进行互作蛋白筛选，对阳性菌液测序结果进行功能预测。共得到IbHT1拟互作蛋白10个(表2)。这些研究结果为今后进一步阐明IbHT1基因调控甘薯抗旱性的分子机制奠定了基础。

3 讨论

干旱作为一种重要的非生物胁迫，严重威胁植物的生长发育[1-2]。蛋白激酶为一类重要的干旱响应蛋白，在植物响应干旱胁迫中起到重要的调控作用[4]。部分蛋白激酶参与植物抗旱性调控的作用已经被报道[8-13]。然而，蛋白激酶种类众多，仍有许多基因有待挖掘。MAPK级联途径在植物应对干旱等非生物胁迫中发挥着重要作用[39]。MAPK信号通路是一个级联磷酸化的过程，MAPK级联由MAPKKK (MAP3K)、MAPKK (MKK)和MAPK (MPK) 三部分构成。MAP3K位于MAPK级联途径的起始位置，上游信号激活MAP3Ks，进而磷酸化激活MAP2Ks，活化的MAP2Ks作用于特定的MAPK，最终，被激活的MAPK磷酸化下游蛋白而行使功能[6-7]。HT1蛋白激酶属于MAPKKK蛋白激酶[14]。在拟南芥中的研究表明，HT1参与二氧化碳相关的气孔运动[15-18]。目前，有关蛋白激酶在甘薯抗旱性中作用的研究很少，特别是HT1在甘薯抗旱性中的作用未见报道。

本研究从甘薯抗旱品系徐薯55-2中克隆得到IbHT1基因，该基因编码蛋白具有一个保守的STKc-MAP3K-Like蛋白激酶结构域(图1)，IbHT1蛋白定位于细胞膜上，无转录激活活性(图3和图4)。IbHT1基因受PEG-6000诱导下调表达(图2)。在正常条件下，IbHT1过表达植株鲜重显著低于野生型，干扰植株与野生型无显著差异，认为该基因的过表达在正常条件下也影响了植株生长，这一结果类似于甘薯抗旱性负调控因子IbbHLH118和IbNIEL的过表达植株在正常条件下鲜重显著低于野生型[29,40]。在干旱条件下，过表达IbHT1基因降低了甘薯的抗旱性，而RNA干扰IbHT1基因增强了甘薯的抗旱性(图7)。因此，IbHT1基因负调控甘薯的抗旱性。

另外，本研究通过酵母双杂交筛选得到包括MYB1R1和VOZ1在内的10个与IbHT1互作的蛋白(表2)。MYB是植物最大的转录因子家族之一，其包含R2R3-MYB、MYB1-R、4R-MYB和R1R2R3-MYB四个亚家族，广泛参与包括抗旱在内的植物多个非生物胁迫过程[41-42]。在拟南芥中，AtMYB2、AtMYB32、AtMYB33、AtMYB65和AtMYB101参与植物抗旱胁迫响应过程[43-45]。在水稻中，过表达OsMYB2和OsMYB6植株的抗旱性显著增强，而OsMYB1R1负调控水稻的抗旱性[46-48]。在棉花中，GbMYB5正调控植株抗旱性[49]。StMYB1R-1正调控马铃薯的抗旱性[50]。VOZ蛋白是一种植物特异性的转录因子家族，已有研究表明，其广泛参与包括抗旱在内的植株非生物胁迫响应[51]。AtVOZ1负调控拟南芥的耐热性[52]。GmVOZ1G参与大豆的干旱响应[51]。在番茄中SlVOZ1通过影响蛋白激酶SlOST1的稳定性，参与调控植株抗旱性[53]。因此，我们推断IbHT1可能通过与MYB1R1和VOZ1蛋白互作参与调控甘薯的抗旱性。

4 结论

本研究从甘薯品系徐薯55-2中克隆得到IbHT1基因，该基因CDS全长1140 bp，编码379 aa，具有一个保守的STKc-MAP3K-Like结构域，该蛋白定位于细胞膜上。基因组全长2796 bp，由3个外显子和2个内含子构成。IbHT1基因受PEG-6000诱导下调表达，RNA干扰该基因显著增强甘薯的抗旱性。推断IbHT1可能通过与MYB1R1和VOZ1蛋白互作负调控甘薯的抗旱性。本研究为甘薯抗旱育种提供了新的候选基因，为今后进一步阐明IbHT1在甘薯中的功能和分子调控机制奠定了基础。

本研究由财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-10)资助。

^*通信作者: 刘庆昌, E-mail: liuqc@cau.edu.cn

第一作者联系方式: E-mail: 978067241@qq.com

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期刊简介

《作物学报》是中国科学技术协会主管、中国作物学会和中国农业科学院作物科学研究所共同主办、科学出版社出版的有关作物科学的学术期刊。前身可追溯到1919年创办的《中华农学会丛刊》。主要刊载农作物遗传育种、耕作栽培、生理生化、种质资源以及与作物生产有关的生物技术、生物数学等学科具基础理论或实践应用性的原始研究论文、专题评述和研究简报等。《作物学报》从2001年起连续23年被中国科技信息研究所授予“百种中国杰出学术期刊”称号。2013年和2015年被国家新闻出版广电总局评为“百强科技期刊”, 2011年和2018年获“中国出版政府奖期刊奖提名奖”。据北京大学图书馆编著的《中文核心期刊要目总览》登载, 《作物学报》被列在“农学、农作物类核心期刊表”的首位。2019-2023年获中国科技期刊卓越行动计划梯队项目资助。2020年入选农林领域中国高质量科技期刊分级目录T1类。

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