6 云南省严建兵专家工作站, 云南景洪 666100
摘要 Abstract
前期，通过构建多个Bbm和Wus2超表达辅助载体，在4个玉米骨干自交系上成功实现了遗传转化，平均转化效率达到19.5% [15]。但这种方法是否适合所有自交系，转化效率能达到多高，尚不知晓。为了建立适用于所有玉米自交系的遗传转化体系，本研究通过提高农杆菌瞬时侵染效率，共表达Bbm和Wus2基因和目的基因，在体细胞胚分化阶段，通过低浓度(5 mg L-1)草丁膦筛选（体细胞少或易水渍化材料分化不筛选)，苗期高浓度(10 mg L-1)草丁膦筛选的方法，获得不含辅助基因的转基因苗。在超过131个骨干自交系上进行了测试，成功在104个自交系上获得阳性转基因植株，基本建立了一个适用所有玉米自交系的快速遗传转化体系，表明了玉米无基因型限制遗传转化的可行性，可以对骨干自交系直接进行基因编辑，为下一步玉米生物育种的应用奠定了重要的技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料
转化受体包括KN5585、Zheng58、Jing724和京92等在内的131个玉米自交系(表1)，均种植于云南省西双版纳州。
1.1.2 菌株和载体
农杆菌菌株为EHA105和AGL1。载体骨架为pCAMBIA3300，pWMDR002过表达Bbm和Wus2 [15]，不含筛选标记基因。p173001为Ubi驱动报告基因GFP和35S驱动筛选标记基因bar。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体获取及侵染
(1)将授粉后9~12 d，幼胚大小为1.5~2.0 mm的玉米幼穗收获，剥去苞叶，去除花丝，用20%次氯酸纳消毒15 min后清水洗4~5遍。
(2)在超净台中，用手术刀削去籽粒1/3，用无菌刮铲小心将幼胚取出放在装有悬浮液的EP管中备用。
(3)将幼胚悬浮液去除，加入200 µL悬浮液，1.5 mm幼胚45℃热激3 min，2.0 mm幼胚热激5 min后，吸去悬浮液，按pWMDR002∶p173001=1∶10的比例加入农杆菌菌液，侵染5 min。
1.2.2 共培养和分化
将侵染后的幼胚倒在共培养培养基上晾干表面菌液，在23℃培养箱黑暗培养1~2 d; 将幼胚转移到休息培养基，于28℃培养7 d，转移到分化培养基中。培养基参考已发表文献[16]，并做适当修改。
1.2.3 筛选生根
将分化出的幼苗转移到含有10 mg L-1草铵膦的培养基上培养2周。将存活的幼苗转移到生根管中培养，叶片长至顶盖炼苗，移入土壤中栽培。
1.2.4 转基因植株鉴定
取玉米叶片提取基因组DNA, 利用载体特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳和测序确认目的基因，选择Bar阳性而Bbm/Wus2阴性的植株移栽。Bar阳性检测引物(BAR4-F: 5'-GCG GTC TGC ACC ATC GTC AA-3'; BAR4-R: 5'-AGA TCT CGG TGA CGG GCA GGA C-3')，Bbm/Wus2基因检测引物(3369-F1: 5'-TGC TCA GAT GGG GTA CGA GA-3'; 3369-R1: 5'-CAG ACA CGA GAG GTT GCA GA-3')。
2 结果与分析
2.1 Bbm和Wus2能使大部分自交系形成体细胞胚
利用先前报道的Zm-PLTPpro驱动bbm和Zm-Axig1pro驱动wus2的pWMDR002载体[7,15]与p173001载体1∶10混合转化玉米幼胚，在转化4 d后即可观察到幼胚盾片表面有凸起，之后快速生长。在测试的34个自交系中有29个自交系能诱导出体细胞胚。按体细胞胚起始和成苗效率可以将自交系分为3种类型，易转化、能转化和难转化，分别以KN5585、Jing724和Jing92为代表。易转化KN5585自交系在幼胚盾片起始非常多体细胞胚(图1-A); 能转化Jing724自交系起始体细胞胚较少(图1-B); 难转化Jing92自交系起始体细胞胚小并且较少(图1-C)，且批次之间存在差异，盾片易水渍化(图1-D)。Bbm和Wus2能使绝大部分玉米自交系起始体细胞胚，但不同自交系起始体细胞胚能力和起始体细胞胚数量存在差异(图1)。
2.2 优化侵染方式提高侵染效率
体细胞胚起始受侵染效率影响。为了测试影响侵染效率的关键因素，对农杆菌菌株和侵染方式进行了探索。将p173001载体分别转入EHA105和AGL1农杆菌菌株，对KN5585和Jing92进行侵染，侵染后第2天观察瞬时荧光，结果表明，在两个自交系中，EHA105瞬时荧光均略微高于AGL1菌株(图2)。
先前研究表明，高温处理幼胚可以促进侵染[17]，以KN5585和Jing724为受体材料，设置25℃ (对照)、42℃和45℃ 3个温度梯度，幼胚经过热激处理3~5 min后进行农杆菌侵染，侵染后第2天进行荧光观察。结果表明，所有处理中KN5585瞬时侵染效率均高于Jing724(图3); 不热激处理(25℃) 2个自交系几乎都不能被农杆菌侵染(图3-F, L); 42℃热激处理后，KN5585中每个幼胚边缘都有微弱荧光(图3-D)，Jing724部分幼胚边缘有微弱荧光(图3-J)。45℃处理瞬时转染效率最高，KNN5585所有幼胚边缘有强荧光信号(图3-B)，Jing724大多数幼胚盾片边缘有荧光信号(图3-H)。因此，在农杆菌转染前，45℃处理幼胚可以促进农杆菌瞬时侵染。
2.3 筛选抑制体细胞胚成苗
通过优化侵染方式使能转化自交系及难转化自交系获得体细胞胚，然而，在5 mg L-1草丁膦筛选条件下，能转化自交系Jing724的阳性体细胞胚仍分化慢，发育停滞严重，分化苗少(图4-A); 难转化自交系Jing92完全停止生长褐化死亡，不能出苗(图4-B); 易转化自交系KN5585，在无辅助载体pWMDR002混转的情况下，正常转入173001载体，在10 mg L-1草丁膦筛选下能正常分化成苗，并且阳性率在90%以上。为了验证Jing724和Jing92诱导的体细胞胚能否正常分化，将Jing724用pWMDR002与p173001载体1∶10混合转化、Jing92用pWMDR002单独转化，获得体细胞胚，将体细胞胚放在无筛选剂的分化培养基上获得大量再生植株(图4-C,D)。结果表明，在Jing724和Jing92中5 mg L-1草丁膦筛选浓度可能是导致愈伤和体细胞胚发育停滞，分化不成苗的关键因素之一。后续将针对不同的自交系设置不同的筛选梯度和筛选基因，以提高转化效率。
图4 Jing724和Jing92筛选与不筛选再生对比
2.4 苗筛选是获得阳性苗的有效途径
通过分化不筛选的方式，使能转化和难转化类自交系获得大量再生植株，但大部分是非阳性苗，为了解决这个问题，在分化成苗后添加筛选剂，经过3~5 d的培养，非阳性苗大量被杀死(图5)。本研究通过增加瞬时侵染效率和延迟筛选的方式建立了一个可能适用于所有玉米自交系的快速遗传转化方法，对131个自交系进行转化，有104个自交系获得转基因苗，转化效率介于0.15%~66.67%之间，平均为6.76% (表1)。
图5 苗期筛选
3 讨论
Bbm和Wus2共表达诱导玉米幼胚盾片产生体细胞胚，体细胞胚直接分化成苗，不仅拓宽了可转化自交系范围，提高了玉米转化效率，还大幅缩短转化周期[5,7]。Bbm在体细胞胚发生过程中有促进增殖的功能[18]，Wus2基因具有利他性，Wus2表达后，其蛋白可以移动到邻近细胞，从而使邻近细胞产生体细胞胚[19-20]，Mookkan等[21]利用Bbm和Wus2与目标载体混转实现无筛选转基因。利用Bbm和Wus2共同或Wus2单独做辅助载体转化具有利他性，可以获得不含辅助质粒但含目的基因载体的优质转化苗[15,22-23]。本研究通过将Bbm和Wus2辅助载体和目标载体按1∶10比例转化，结合分化不筛选苗期筛选的方式，在所测试131个自交系中，有104个自交系成功获得不含辅助载体的阳性转化基因苗。基因编辑技术是突破性的生物育种技术，在玉米等主要农作物中应用前景广阔。而基因编辑技术的广泛应用是建立在于无基因型依赖递送技术之上的，本研究基本实现了玉米无基因型依赖的遗传转化技术，这为下一步的基因编辑技术的大规模应用奠定了重要的技术基础。进一步分析导致29个自交系尚无法获得阳性转化苗的原因，可能主要有: (1) 外植体状态很差，导致转化失败，可能是因为有些外植体是温带背景不适合在云南种植有关。(2) 外源基因递送效率低，高效递送进受体是目前遗传转化的主要障碍之一[24]，本研究利用瞬时表达系统，通过测试农杆菌菌株及侵染方式，获得较好的瞬时侵染效果。农杆菌毒力蛋白也是影响递送的关键因素之一，三元载体可以容纳更多、更兼容的毒力蛋白以及辅助基因[3]，推测利用三元载体可以实现这些顽拗自交系的递送，拓宽可转化自交系，也有利于提高能转化自交系的转化效率。(3) 尚有内在机制待揭示，Wang等[25]研究表明，体细胞命运转变为胚胎细胞需要三个层级，第一层级也是处于层级顶端为外植体的状态，外植体需要具有一定胚性; 第二层级为生长素，生长素可以诱导染色质开放和引起基因表达变化; 第三层级是AP2、B3和NF-Y转录因子，包括Bbm、LEC1和LEC2等直接起始体细胞胚发生。玉米转化中混转少量的Bbm和Wus2做辅助基因即可诱导体细胞胚发生，表明大部分玉米自交系的幼胚盾片具有一定胚胎特性。对于Bbm和Wus2也难以转化的自交系或许可以通过叠加更多的再生基因，改变盾片细胞类型，使之具有胚胎特性实现转化[26-27]，或者调整再生过程。这是下一步可以尝试的方向。利用Bbm和Wus2辅助转化，难转化Jing92在体细胞胚分化期间筛选，导致阳性体细胞胚畸形或停止发育(图4)，而不筛选时阴性苗生长优于阳性苗，10 mg L-1的草丁膦对苗进行筛选，可以杀死90%的阴性苗，获得转基因植株，草丁膦可能并不适合体细胞胚分化期的筛选[5]。选择合适的抗性基因和筛选剂，通过让阳性细胞具有生长优势也是提高转化效率的有效方式。下一步考虑使用幼叶或其它的组织作为外植体，也可能是克服目前少数自交系遗传转化瓶颈的有效措施之一，值得尝试。
4 结论
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