亮点论文 | 利用基因编辑技术创制低谷蛋白水稻种质

学术三农 2024-07-04 11:36 北京

周田田^1,2 唐兆成¹ 李笑¹ 朱鹏¹ 邓晶晶¹ 杨郁文¹ 张保龙^1,2 郭冬姝^1,*

1 江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所，江苏南京 210014

2 南京农业大学生命科学学院，江苏南京 210014

摘要 Abstract

水稻(Oryza sativa L.)是重要的粮食作物，蛋白质是稻米的第二大营养物质。肾脏病人通常需要限制蛋白质的摄入量以减轻肾脏的负担和控制病情进展。稻米蛋白中谷蛋白含量最高，且易被人体消化。本研究以LGC-1作为供体亲本培育出的粳稻品种为转基因受体，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术一次性敲除谷蛋白A (Glutelin A，GluA)亚家族编码基因GluA1、GluA2和GluA3，获得了不含转基因元件的谷蛋白含量约为1.8%的低谷蛋白种质，并对所得种质的稻米品质和农艺性状进行了全面评估。所得低谷蛋白种质外观品质较好，相比于受体品种垩白度降低、糙米率和精米率提高。本研究为创制低谷蛋白水稻品种提供了一种高效、简便的方法，为培育适合肾病患者的功能性水稻品种提供了一种新的遗传材料。

同行专家评语

肾脏病人需要限制蛋白质的摄入量，以减轻肾脏负担。水稻是我国最主要的粮食作物之一，降低稻米谷蛋白含量可以减少易消化蛋白的含量，进而控制肾脏病人的病情进展。该研究以低谷蛋白水稻品种LGC-1为受体材料，利用CRISPR技术获得了A亚家族谷蛋白编码基因GluA1、GluA2和GluA3基因敲除材料，对这些材料进行了表型观察、蛋白质和稻米外观品质分析，发现获得的遗传材料谷蛋白含量显著降低，而外观品质显著提高。文章内容详实、结果可靠，具有一定的实用价值和生产意义，建议修改后发表。

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，稻米是全球超过半数人口重要的能量来源[1]。稻米中含量最高的营养成分是淀粉，蛋白质是含量仅次于淀粉的第二大营养成分，约占稻米干重的6%~10% [2]，水稻种子中的蛋白质主要是贮藏蛋白，根据在不同溶剂中的溶解性不同，贮藏蛋白又可以分为谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白等4种组分。其中谷蛋白的含量最高，占总蛋白含量的60%~80% [3]。谷蛋白位于蛋白体II中，容易被人体消化吸收，对于一般的消费者而言，谷蛋白具有更高的营养价值。然而，对于肾脏病人和并发肾脏机能损害的糖尿病人来说，摄入过多的易消化蛋白会增加肾脏负担，导致病情恶化[4]。因而创制低谷蛋白的水稻品种，对于以稻米为主食的肾脏病患者具有重要意义。

水稻谷蛋白由15个基因编码，它们被分为4个亚家族：GluA、GluB、GluC和GluD [5-6]，其中12个基因具有完整的开放阅读框，A亚家族和B亚家族成员最多，分别为3个和7个[3,6]。有研究报道，日本学者通过化学诱变手段获得一个种子胚乳谷蛋白含量显著降低的水稻株系NM67，进一步通过回交选育出第一个低谷蛋白水稻种质LGC-1 (Low Glutelin Content-1) [7]。与普通水稻相比，LGC-1谷蛋白含量显著降低，约为受体亲本的46% [7]。目前，该种质作为低谷蛋白性状的供体亲本，培育成了一些商业品种[8-9]。然而，该种质谷蛋白含量的下降幅度有限。

近年来，随着基因编辑技术的兴起，CRISPR/Cas9已成为改变目标基因表达和靶向作物改良的强大基因工程工具[10]。目前，有研究利用基因编辑技术敲除多个谷蛋白编码基因，获得了不同程度的低谷蛋白种质[11-12]。然而这些低谷蛋白种质外观品质较差，针对这一缺陷，同时为了创制更为丰富的低谷蛋白水稻种质，本研究以LGC-1作为供体亲本培育出的粳稻品种为转基因受体，利用基因编辑技术同时对3个A亚家族谷蛋白编码基因进行敲除，获得了外观品质较好、谷蛋白含量约为1.8%的水稻株系，并对其营养品质、外观品质、食味品质和农艺性状进行了全面分析，为后续利用这一种质培育优质低谷蛋白水稻品种提供了理论基础。本研究所创制的低谷蛋白水稻种质对于培育适合特殊人群，如肾脏病患者等食用的水稻品种具有重要的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转基因受体品种是以含有Lgc1突变的品种作为低谷蛋白性状供体，通过杂交选育获得的粳稻品种，命名为LGC-1；普通粳稻品种苏秀867 (江苏省农作物种质资源库提供)。

1.2 基因编辑靶标位点的选择和载体构建方法

比对GluA1和GluA2基因编码区DNA序列，在2个基因序列一致的区段设计相距89 bp的2个靶标位点，分别合成引物GluA1/2-1F、GluA1/2-1R、GluA1/2-2F、GluA1/2-2R；根据GluA3基因编码区和5′转录调控区序列，设计相距232 bp的2个靶标位点，分别合成引物GluA3-1F、GluA3-1R、GluA3-2F、GluA3-2R，引物序列见表1；用去离子水稀释引物至10 μmol L^-¹，正反引物等体积混合，梯度退火(95℃，3 min；95~30℃缓慢降温，0.1℃ min^-¹)形成双链；利用Gold-Gate策略构建基因编辑植物表达终载体[13]。

1.3 农杆菌介导的水稻遗传转化

利用化学转化法将测序正确的质粒转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (上海唯地生物技术有限公司)；参考Miao等[14]的方法利用农杆菌介导将基因编辑载体转入受体水稻品种成熟胚诱导的愈伤组织，在含有50 mg L^-¹终浓度的潮霉素B的培养基上筛选约4周，在含有25 mg L^-¹终浓度的潮霉素B的培养基上分化出苗。

1.4 靶标位点的基因型鉴定

利用CTAB法提取水稻叶片总DNA (CTAB配方：1 mol L^-¹ Tris-HCl，0.5 mol L^-¹ EDTA，1.4 mol L^-¹ NaCl，2% CTAB)。利用靶标位点侧翼序列的特异性引物扩增含有靶标位点的片段(PCR程序：95℃ 2 min；94℃ 20 s，56℃ 20 s，72℃ 1 min，35个循环)，PCR产物直接进行Sanger测序，引物序列见表1。

1.5 不含转基因元件株系的鉴定

以水稻叶片总DNA为模板，利用潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase, hpt)基因和Cas9基因特异性引物进行PCR扩增(PCR程序：95℃ 2 min；94℃ 20 s，56℃ 20 s，72℃ 1 min，35个循环)，1%琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，检测T₁代植株中转基因元件，引物序列见表1。

1.6 成熟水稻种子总蛋白提取和蛋白质组分检测

每个待测样品各取5粒成熟种子，取糙米或精米，将种子在研钵中碾碎，取100 mg转移到1.5 mL离心管，取100 mg米粉加入800 μL蛋白提取缓冲液，28℃水浴30 min，12,000转 min⁻¹，离心10 min取100 μL，加40 μL 5×上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)，100℃水浴10 min，离心取上清上样[12]。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)根据Laemmli [15]的方法制备不连续缓冲液体系，本试验采用12%的分离胶和5%的浓缩胶。电泳结束后凝胶用0.1%考马斯亮蓝R-250染色1 h，用脱色液脱色至背景清晰，最后采用Tanon 3500凝胶成像仪照相。

1.7 稻米谷蛋白含量测定

按Osborne法对稻米样品的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白进行逐级分离提取，以牛血清蛋白为标准样品，采用考马斯亮蓝法测定谷物及制品中蛋白组分含量[16]。

1.8 稻米的品质性状和营养品质测定

采用凯氏定氮法测定糙米总蛋白含量[17]，转换系数5.95；采用Foss公司生产的近红外谷物分析仪(Infrared 1241 grain analyzer)测定精米的蛋白质[18]；采用耐热淀粉酶测定糙米总淀粉含量；采用索氏提取法测定糙米总脂肪酸含量[19]；采用Rigol L3000高效液相色谱仪、Sepax C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)测定糙米中结合态氨基酸含量[20]；按照国家标准《GB/T17891-2017优质稻谷》进行稻米的糙米率、精米率、整精米率、垩白粒率、垩白度、透明度6项指标的测定。用米饭食味计(佐竹)测定米饭的外观、黏度、硬度和平衡度4项指标[21]。

1.9 扫描电子显微镜观察

利用双面刀片将成熟稻米籽粒从中间切开，尖端也削去，剩下1 mm左右的薄片，贴在导电胶布上，直接喷金，利用扫描电子显微镜(EVO-LS10，蔡司)按照操作手册的方法观察稻米横截面淀粉粒形态。

1.10 稻米产量性状测定

待水稻成熟后选取代表性样本10株，统计株高和有效穗数；选取3株长势良好，穗数处于平均值左右的单株，用水漂法区分实粒和瘪粒后，统计结实率：实粒/总粒数；每株总粒数除以平均有效穗数为每穗粒数；在每株水稻中的实粒中随机取5份200粒种子，互相误差在0.05 g以内，记为一次千粒重，统计3株的千粒重后取平均值。

1.11 数据统计方法

对于重复的测定值，利用IBM SPSS Statistics 22软件采用最小显著差异法(Least significant difference, LSD)进行平均值的多重比较，显著性概率水平设定为0.01或0.05。

2 结果与分析

2.1 CRISPR/Cas9构建基因编辑载体

本研究以LGC-1作为供体亲本培育出的粳稻品种为转基因受体，水稻谷蛋白编码基因GluA1、GluA2和GluA3作为基因编辑靶标，构建功能缺失突变体。为了简化基因型鉴定方法，本研究在每个目标基因区段设计2个靶标位点，以筛选缺失较大片段的突变体，可以利用琼脂糖凝胶电泳直观地通过条带大小来判断靶标位点基因型，不需要进行Sanger测序。GluA1和GluA2基因编码区核苷酸序列一致性高达94.9%，为简化载体构建，在2个基因的第一个外显子上选择序列相同的靶标位点，2个靶标位点相距89 bp，可以同时靶向2个基因(图1-A)。GluA3与GluA1和GluA2编码区核苷酸序列一致性约为80%，找不到和GluA1和GluA2序列相同的靶标位点，故针对GluA3设置2个相距232 bp的靶标位点，分别位于5′非翻译区和第一个外显子(图1-B)，该区段缺失可能影响GluA3的转录和翻译。如图1-C所示，本研究利用组成型表达的玉米Ubiquitin1基因启动子驱动来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9基因，Cas9基因5′端和3′端含有核定位信号的编码序列，分别利用水稻RNA聚合酶III型启动子U3b和U6b驱动基因特异性靶标位点序列和single guide RNA (sgRNA)[13]，获得同时靶向3个谷蛋白编码基因的植物表达载体，命名为CRISPR-GluA123。

图1 谷蛋白编码基因靶标位点及载体T-DNA区段示意图

A：GluA1和GluA2基因结构，黄色和桔黄色方框分别代表GluA1和GluA2基因的外显子，外显子间的黑色短线代表内含子，蓝色和绿色线显示基因编辑靶标位点的位置，带下画线的红色字母显示基因编辑靶标位点序列，带下画线的黑色字母显示PAM (protospacer adjacent motif)序列；B：GluA3基因结构，浅蓝色方框代表GluA3基因的外显子，外显子间的黑色短线代表内含子，玫红色短线和粉色线显示基因编辑靶标位点的位置，带下画线的红色字母显示基因编辑靶标位点序列，带下画线的黑色字母显示PAM序列；C：基因编辑载体T-DNA区段示意图。ZmpUBI：玉米Ubiquitin1基因启动子；SpCas9：针对水稻进行密码子优化后的来源于酿脓链球菌的Cas9基因；NOST：NOS终止子；3：水稻U3b启动子；6：水稻U6b启动子；GluA1/2-1：GluA1和GluA2基因的第1个靶标位点序列；GluA1/2-2：GluA1和GluA2基因的第2个靶标位点序列；GluA3-1：GluA3基因的第1个靶标位点序列；GluA3-2：GluA3基因的第2个靶标位点序列；35S Promoter：花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus) 35S启动子；HygR：潮霉素抗性基因；35ST：35S终止子；LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界。

2.2 三基因突变体的获得

利用农杆菌介导将CRISPR-GluA123转入受体品种LGC-1，共得到26株T₀代潮霉素抗性植株，根据GluA1、GluA2和GluA3基因靶标位点的侧翼序列设计能够区分3个基因的特异性引物(表1)。提取T₀代潮霉素抗性植株叶片总DNA，利用基因特异性引物进行扩增，除了能够观察到与预期长度相仿的片段，还可以观察到较长片段的缺失。Sanger测序结果表明三基因同时发生突变的比例约为35%。选取3个基因均发生缺失突变的T₀代植株种植在土中，收获T₁代自交种子，对T₁代幼苗进行基因型鉴定。鉴定到2个3个基因都发生较大片段缺失的纯合株系(图2-A)，利用Sanger测序确定靶标基因缺失片段的精确序列(图2-B)。为了获得不含转基因元件的突变株，利用Cas9和潮霉素基因表达盒的特异性引物对选定株系的纯合T₁代单株进行PCR鉴定(图2-C)。本研究选择2个独立的不含转基因元件的纯合突变株用于后续研究，分别命名为GluA-2-11和GluA-3-6。

图2 基因型鉴定及Sanger测序峰图

A：琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型；B：Sanger测序峰图；C：转基因元件检测。Marker：DNA分子量标准；WT：野生型粳稻苏秀867；LGC-1：受体品种；+CK：基因编辑质粒阳性对照；–CK：PCR阴性对照；LGC1：野生型LGC1位点；Lgc1：突变型Lgc1位点；GluA1：GluA1基因位点；GluA2：GluA2基因位点；GluA3：GluA3基因位点；Cas9：Cas9基因表达盒；Hyg：潮霉素抗性基因表达盒。A中GluA1、GluA2和GluA3基因的较长条带代表野生型基因型，较短条带代表突变型基因型；B中“*”和“·”分别标注基因序列缺失区段两侧的碱基；A和C中左侧箭头标注分子量标准对应的条带大小。

如图2-A、B所示，在GluA-2-11中，GluA1基因第一个外显子缺失88 bp，在第33个氨基酸后产生移码突变，随后再翻译42个氨基酸后提前终止；GluA2基因第一个外显子缺失89 bp，在第33个氨基酸后产生移码突变，随后再翻译4个氨基酸后提前终止；GluA3基因在5′ UTR区和第一个外显子上缺失250 bp，可能造成转录或翻译无法正常起始。在GluA-3-6中，GluA1基因第一个外显子缺失89 bp，在第33个氨基酸后产生移码突变，随后再翻译4个氨基酸后提前终止；GluA2基因的突变形式与GluA-2-11相同；GluA3基因在5′ UTR区和第一个外显子上缺失232 bp，同样可能造成转录或翻译无法正常起始。

2.3 三基因突变体籽粒蛋白含量和氨基酸组成

蛋白组分定性分析结果如图3-A、B所示，在野生型品种中，谷蛋白α亚基和β亚基对应条带强度最大；在受体品种LGC-1中，谷蛋白对应条带强度明显减弱；而在GluA-2-11和GluA-3-6株系中几乎观察不到谷蛋白对应条带，而醇溶蛋白对应条带强度大于野生型品种。糙米和和精米贮藏蛋白组分变化趋势一致。精米谷蛋白含量定量测定的结果显示，受体品种谷蛋白含量为2.4%，突变体谷蛋白含量为1.8%，较受体品种下降了25%。氨基酸组成测定结果如图3-C所示，谷蛋白富含天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸等必需氨基酸，和野生型及受体品种比较，突变体品种的天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸含量明显下降。

图3 水稻SDS-PAGE和氨基酸组成测定

A：糙米蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳；B：精米蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳；C：稻米氨基酸组成测定结果。M：蛋白marker；WT：野生型粳稻苏秀867；LGC-1：受体品种；GluA-2-11和GluA-3-6：突变体；A和B右侧竖线表示不同贮藏蛋白组分；C中Asp~Lys代表不同氨基酸，不同字母表示P < 0.01水平差异显著。

2.4 三基因突变体稻米主要营养成分含量

除了稻米贮藏蛋白含量，本研究进一步检测了受体稻米和突变体中其他主要营养成分的含量。如图4-A所示，GluA-2-11和GluA-3-6的糙米总蛋白含量分别为10.00%和9.22%，显著高于受体品种(8.68%)，增幅分别约为6.00%和11.50%；如图4-B所示，GluA-2-11和GluA-3-6的精米总蛋白含量分别为8.30%和8.33%，显著高于受体品种(7.57%)，增幅约为10.00%。淀粉是稻米含量最高的营养成分。如图4-C所示，受体品种中总淀粉含量为73.84%，GluA-2-11的总淀粉含量为72.78%，与受体品种没有显著性差异，GluA-3-6的总淀粉含量为71.30%，显著低于受体品种，降幅约为3.40%。利用气相色谱和质谱联用(GC-MS)法测定糙米总脂肪酸含量，如图4-D所示，受体品种中总脂肪酸含量为1.12%，GluA-2-11的总脂肪酸含量为1.11%，GluA-3-6的总脂肪酸含量为1.08%；图4-H、I、J为总脂肪酸检测的总离子流图，说明突变体和受体品种之间差异不显著。利用扫描电子显微镜观察成熟稻米的横截面，如图4-E、F、G所示，LGC-1、GluA-2-11和GluA-3-6的稻米横截面均可观察到典型的多角形淀粉粒，突变体与受体品种没有明显差异。

图4 稻米主要营养成分含量检测结果

A：糙米总蛋白含量；B：精米总蛋白含量；C：糙米总淀粉含量；D：糙米总脂肪酸含量。A~D：每个样品重复测定3次，不同小写字母代表显著性差异(P < 0.01)；E~G：LGC-1、GluA-2-11和GluA-3-6成熟种子横截面扫描电镜观察结果，标尺为10 μm；H~J：LGC-1、GluA-2-11和GluA-3-6成熟种子总脂肪酸检测的总离子流图。

2.5 三基因突变体稻米外观品质

如表2所示，GluA-2-11和GluA-3-6的糙米率分别为83.22%和82.73%，显著高于受体品种(76.19%)；GluA-2-11和GluA-3-6的精米率分别为72.91%和72.83%，显著高于受体品种(68.33%)；GluA-2-11和GluA-3-6的垩白度分别为1.23%和1.23%，在0.05概率水平上显著低于受体品种(2.75%)；GluA-2-11和GluA-3-6在长/宽均值、整精米率、垩白粒率和透明度4个指标上和受体品种没有显著差异。图5-B~G展示了稻米的外观表型。

图5 水稻株型和稻米外观表型

A：LGC-1、GluA-2-11和GluA-3-6成株外观；B~D：LGC-1、GluA-2-11和GluA-3-6种子外观；E~G：LGC-1、GluA-2-11和GluA-3-6精米外观。A中标尺为20 cm；B~G中标尺为1 cm。

2.6 稻米食味品质

本研究利用米饭食味计对GluA-2-11、GluA-3-6和受体品种的食味品质进行测定。如表3所示，GluA-2-11、GluA-3-6和受体品种在外观、硬度、黏度、平衡度和食味值等方面均没有显著性差异。

2.7 稻米农艺性状

在水稻成熟期，GluA-2-11、GluA-3-6和受体品种在株型上没有明显差异(图5-A)。如表4所示，GluA-2-11和GluA-3-6的株高分别为87.74 cm和84.72 cm，均与受体品种(86.16 cm)没有显著性差异，但GluA-2-11的株高显著高于GluA-3-6；GluA-2-11和GluA-3-6的千粒重分别为20.55 g和20.46 g，均显著低于受体品种(21.34 g)，降幅分别为3.7%和4.1%；而突变体的分蘖数、每穗粒数和结实率与受体品种都没有显著性差异。

3 讨论

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)已成为威胁人类健康的重要慢性疾病，中国流行病学调查结果显示我国成人慢性肾脏病患病率高达10.8%，据此估计总数高达1.2亿人[22]，培育出肾脏病人等需要的易消化蛋白含量低的品种已成为功能水稻育种的新目标。1993年，日本学者通过乙烯亚胺(ethyleneimine)诱变获得了B亚家族谷蛋白编码基因表达下调的突变体LGC-1，该突变体谷蛋白含量约为受体品种的46% [7]。此后，LGC-1被引入中国并用于培育优质低谷蛋白水稻新品系，如“W3660”、“2054”等[8-9]。但这些以LGC-1作为低谷蛋白性状供体的品系谷蛋白含量与LGC-1相仿，在降低谷蛋白含量方面没有更大突破。为了进一步降低稻米谷蛋白含量，本研究以LGC-1作为供体亲本培育出的粳稻品种为转基因受体，利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术一次性敲除全部3个A亚家族谷蛋白编码基因，成功获得了谷蛋白含量更低的株系GluA-3-6和GluA-2-11。SDS-PAGE结果显示突变体的谷蛋白含量和野生型相比显著降低，谷蛋白含量定量分析结果显示受体品种谷蛋白含量约为2.4%，本研究所获得的2个突变体谷蛋白含量约为1.8%，较受体降低了25.0%。本研究中谷蛋白含量降幅和已报道的谷蛋白编码基因多突变体中谷蛋白含量最低的株系相近[12]，但谷蛋白绝对含量更低。这可能是基因编辑受体品种谷蛋白含量不同，或者种植管理条件不同等因素造成的。

基因编辑受体品种以LGC-1作为供体亲本选育而成，B亚家族谷蛋白基因表达水平显著降低，但是由于LGC-1中抑制基因表达的可能机制是RNA干扰，所以仍有较低水平的B亚家族谷蛋白基因表达[23]，而本研究敲除了3个A亚家族谷蛋白编码基因，尚未对GluC和GluD基因进行敲除，所以突变体谷蛋白含量相比于受体品种LGC-1显著降低，但没有降为0。如果期望获得谷蛋白含量更低甚至为0的种质，可以进一步对其他谷蛋白编码基因进行多基因敲除。除了谷蛋白，球蛋白也是一种消化性能较好的蛋白[24]，后续可以利用基因编辑技术等对球蛋白进行敲除，以获得易消化蛋白含量更低的水稻种质。考虑到储藏蛋白的组成和含量可能对稻米中其他营养物质存在较为复杂的调控作用[25]，如果敲除更多贮藏蛋白编码基因可能对稻米品质和形态产生更为复杂的影响，后续在进一步创制更低谷蛋白含量的种质时，可以考虑设计不同的基因敲除组合，选择对稻米品质影响较小的敲除方式。

与基因编辑受体相比，突变体总蛋白含量稍有所上升。有研究表明，水稻贮藏蛋白编码基因在转录水平和蛋白水平上可能存在补偿机制[26]，部分谷蛋白编码基因表达的下调可能导致其他谷蛋白编码基因和醇溶蛋白编码基因表达的上调[7,12]。由于本研究敲除了全部A亚家族谷蛋白编码基因，结合基因编辑受体品种中B亚家族谷蛋白基因表达显著下调的机制，总蛋白含量上升的表型可能是其他谷蛋白或其他贮藏蛋白基因表达的补偿机制造成的。本研究所得突变体虽然总蛋白含量略有提高，但是谷蛋白占总蛋白的比例显著下降，后续可以结合栽培和肥水管理等措施控制总蛋白含量在较低的水平，获得谷蛋白含量更低的稻米。

已有研究表明，水稻谷蛋白含量的降低伴随着醇溶蛋白含量的升高[7,12]。本研究蛋白组分电泳分析结果也支持了这一结论。有研究表明醇溶蛋白可能对小鼠损伤之后的胃粘膜具有保护作用[27]，后续可以进一步研究本文所得低谷蛋白种质在胃粘膜保护方面的作用；目前，有研究证明低谷蛋白大米对人体肠道微生物具有一定益处，可以提高短链脂肪酸含量以及丰富肠道有益菌群[28]，说明低谷蛋白大米具有被加工成不同功能性食品的潜力。

除了蛋白相关性状，本研究进一步检测了突变体的其他营养成分、外观品质、食味品质和农艺性状。两个独立的突变株系中一个株系的总淀粉含量与受体品种相当，另一株系总淀粉含量下降，但降幅很小。突变体淀粉颗粒形态都保持正常状态，表现为紧密排列的多角形结构。突变体总脂肪酸含量与受体品种相比没有显著差异。与受体品种相比，突变体品种的垩白度显著降低，根据垩白度和稻米品质划分[29]，受体品种属于三级米，突变体品种属于二级米，说明突变体品种保持了较好的外观。有研究报道某些谷蛋白编码基因的缺失突变体表现出稻米垩白度增加的表型[12]。垩白产生的一个直接原因是淀粉粒形态或排布异常，造成淀粉粒之间存在较大空隙[30]。本研究所得突变体的总淀粉含量与受体品种相比没有大幅度变化，淀粉粒的形态和排布也没有明显差异，可以解释本研究所得突变体垩白度没有增加的表型。而稻米垩白产生的调控机制非常复杂，可能是多个基因和多种因素综合作用的结果。稻米中淀粉和蛋白质是含量最高的两种物质[31]，它们在水稻胚乳中的生物合成和沉积受到复杂的转录和翻译水平的协调调节[32-33]，贮藏蛋白的生物合成和积累缺陷可能对淀粉的生物合成和积累产生正向或负向的影响，其中的机制较为复杂[25]，有研究报道谷蛋白含量相同或相近的品系中，稻米营养品质和外观品质可能差异很大，并且不一定存在线形相关关系[11-12]。因此，本研究所得突变体垩白度略低于转基因受体品种的调控机制值得后续深入研究。垩白度和水稻碾磨品质呈负相关[30]，突变体的垩白度相较于受体品种降低，糙米率和精米率相较于受体品种升高。食味品质测定结果表明，突变体品系在外观、硬度、黏度等方面和受体没有明显差异。田间农艺性状统计和表型观察显示，相较于受体品种，突变体除了千粒重略有降低之外，水稻株型和其他外观表型均无明显差异，说明编辑后的株系谷蛋白含量显著低于受体品种，但绝大多数品质性状和农艺性状与受体品种相似。

4 结论

综上所述，本研究利用基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术，以LGC-1作为供体亲本培育出的粳稻品种为转基因受体，敲除全部3个A亚家族谷蛋白编码基因，谷蛋白含量降至1.8%，垩白度低于受体品种，糙米率和精米率高于受体品种。这些研究结果表明利用基因编辑技术可以高效精准敲除谷蛋白编码基因，快速创制谷蛋白含量更低的适合肾脏病患者需求的水稻新种质。值得注意的是，采用不同的谷蛋白基因敲除策略后，稻米品质可能发生不同的变化，说明贮藏蛋白和稻米品质之间有着十分复杂的调控机制，相关调控机制值得进一步深入研究，为稻米品质改良提供理论依据。

致谢感谢华南农业大学刘耀光教授实验室提供基因编辑载体；感谢扬州大学农学院重点实验室提供营养品质和稻米品质测定的实验设备；感谢江苏省农业科学院中心实验室丁林云老师在扫描电镜观察中提供的技术支持。

________________

本研究由江苏省重点研发计划现代农业项目(BE2022365)和江苏省农业科技自主创新项目(cx(21)1002)资助。

* 通信作者: 郭冬姝, E-mail: guods_cau@163.com

第一作者联系方式: E-mail: 2021116027@stu.njau.edu.cn

参考文献

[1] Furukawa S, Mizuma T, Kiyokawa Y, Masumura T, Tanaka K, Wakai Y. Distribution of storage proteins in low-glutelin rice seed determined using a fluorescent antibody. J Biosci Bioeng, 2003, 96: 467–473.

[2] Safdar L B, Foulkes M J, Kleiner F H, Searle I R, Bhosale R A, Fisk I D, Boden S A. Challenges facing sustainable protein production: opportunities for cereals. Plant Commun, 2023, 4: 100716.

[3] He W, Wang L, Lin Q L, Yu F. Rice seed storage proteins: biosynthetic pathways and the effects of environmental factors. J Integr Plant Biol, 2021, 63: 1999–2019.

[4] Mochizuki T, Hara S. Usefulness of the low protein rice on the diet therapy in patients with chronic renal failure. Nihon Jinzo Gakkai Shi, 2000, 42: 24–29 (in Japanese with English abstract).

[5] Okita T W, Hwang Y S, Hnilo J, Kim W T, Aryan A P, Larson R, Krishnan H B. Structure and expression of the rice glutelin multigene family. J Biol Chem, 1989, 264: 12573–12581.

[6] Kawakatsu T, Yamamoto M P, Hirose S, Yano M, Takaiwa F. Characterization of a new rice glutelin gene GluD-1 expressed in the starchy endosperm. J Exp Bot, 2008, 59: 4233–4245.

[7] Iida S, Amano E, Nishio T. A rice (Oryza sativa L.) mutant having a low content of glutelin and a high content of prolamine. Theor Appl Genet, 1993, 87: 374–378.

[8] 万建民, 翟虎渠, 刘世家, 江铃, 杨世湖, 陈亮明, 王春明. 功能性专用水稻品种W3660的选育. 作物杂志, 2004, (5): 58.

Wan J M, Zhai H Q, Liu S J, Jiang L, Yang S H, Chen L M, Wang C M. Breeding of functional rice variety W3660. Crops, 2004, (5): 58 (in Chinese).

[9] 张云辉, 张所兵, 周金云亮, 林静, 汪迎节, 方先文. 水稻低谷蛋白创新种质的选育和鉴定. 植物遗传资源学报, 2015, 16: 158–162.

Zhang Y H, Zhang S B, Zhou J Y L, Lin J, Wang Y J, Fang X W. Enhancement and identification of new rice germplasms with low glutelin content. J Plant Genet Resour, 2015, 16: 158–162 (in Chinese with English abstract).

[10] Lu Y, Wang J Y, Chen B, Mo S D, Lian L, Luo Y M, Ding D H, Ding Y H, Cao Q, Li Y C, Li Y, Liu G Z, Hou Q Q, Cheng T T, Wei J T, Zhang Y R, Chen G W, Song C, Hu Q, Sun S, Fan G Y, Wang Y T, Liu Z T, Song B A, Zhu J K, Li H R, Jiang L J. A donor-DNA-free CRISPR/Cas-based approach to gene knock-up in rice. Nat Plants, 2021, 7: 1445–1452.

[11] Yang Y H, Shen Z Y, Li Y G, Xu C D, Xia H, Zhuang H, Sun S Y, Guo M, Yan C J. Rapid improvement of rice eating and cooking quality through gene editing toward glutelin as target. J Integr Plant Biol, 2022, 64: 1860–1865.

[12] Chen Z H, Du H X, Tao Y J, Xu Y, Wang F Q, Li B, Zhu Q H, Niu H B, Yang J. Efficient breeding of low glutelin content rice germplasm by simultaneous editing multiple glutelin genes via CRISPR/Cas9. Plant Sci, 2022, 324: 111449.

[13] Ma X L, Zhang Q Y, Zhu Q L, Liu W, Chen Y, Qiu R, Wang B, Yang Z F, Li H Y, Lin Y R, Xie Y Y, Shen R X, Chen S F, Wang Z, Chen Y L, Guo J X, Chen L T, Zhao X C, Dong Z C, Liu Y G. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Mol Plant, 2015, 8: 1274–1284.

[14] Miao J, Guo D S, Zhang J Z, Huang Q P, Qin G J, Zhang X, Wan J M, Gu H Y, Qu L J. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system. Cell Res, 2013, 23: 1233–1236.

[15] Takemoto Y, Coughlan S J, Okita T W, Satoh H, Ogawa M, Kumamaru T. The rice mutant esp2 greatly accumulates the glutelin precursor and deletes the protein disulfide isomerase. Plant Physiol, 2002, 128: 1212–1222.

[16] Zhu D W, Zheng X, Yu J, Chen M X, Li M, Shao Y F. Effects of starch molecular structure and physicochemical properties on eating quality of indica rice with similar apparent amylose and protein contents. Foods, 2023, 12: 3535.

[17] Lynch J M, Barbano D M. Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products. J AOAC Int, 1999, 82: 1389–1398.

[18] 张华瑜, 潘永东, 柳小宁, 包奇军. 利用近红外谷物分析仪快速检测青稞粗蛋白质含量研究. 甘肃农业科技, 2020, (1): 33–36.

Zhang H Y, Pan Y D, Liu X N, Bao Q J. Study on content of crude protein of highland barley by near infrared grain analyzer. Gansu Agric Sci Technol, 2020, (1): 33–36 (in Chinese with English abstract).

[19] 王情, 黄谊, 王未, 魏晓蝶, 钱鑫雅, 陈小举, 陈敏敏. 小茴香精油的提取工艺研究. 云南化工, 2023, 50(6): 17–19.

Wang Q, Huang Y, Wang W, Wei X D, Qian X Y, Chen X J, Chen M M. Study on extraction of essential oil from fennel. Yunnan Chem Techn, 2023, 50(6): 17–19 (in Chinese with English abstract).

[20] 赖红芳, 潘立卫, 韦雪梅, 覃国乐, 黄秀香. 柱前衍生-高效液相色谱法测定构树饲料中氨基酸的含量. 中国饲料, 2023, 1(20): 74–78.

Lai H F, Pan L W, Wei X M, Qin G L, Huang X X. Determination of amino acids in Broussonetia papyrifera feed by HPLC with precolumn derivatization. China Feed, 2023, 1(20): 74–78 (in Chinese with English abstract).

[21] 张诚信, 郭保卫, 唐健, 许方甫, 许轲, 胡雅杰, 邢志鹏, 张洪程, 戴其根, 霍中洋, 魏海燕, 黄丽芬, 陆阳, 唐闯, 戴琪星, 周苗, 孙君仪. 灌浆结实期低温弱光复合胁迫对稻米品质的影响. 作物学报, 2019, 45: 1208–1220.
Zhang C X, Guo B W, Tang J, Xu F F, Xu K, Hu Y J, Xing Z P, Zhang H C, Dai Q G, Huo Z Y, Wei H Y, Huang L F, Lu Y, Tang C, Dai Q X, Zhou M, Sun J Y. Combined effects of low temperature and weak light at grain-filling stage on rice grain quality. Acta Agron Sin, 2019, 45: 1208–1220 (in Chinese with English abstract).

[22] GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. Global, regional, and national burden of chronic kidney disease, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet, 2020, 395: 709–733.

[23] Kusaba M, Miyahara K, Iida S, Fukuoka H, Takano T, Sassa H, Nishimura M, Nishio T. Low glutelin content1: a dominant mutation that suppresses the glutelin multigene family via RNA silencing in rice. Plant Cell, 2003, 15: 1455–1467.

[24] Shewry P R, Halford N G. Cereal seed storage proteins: structures, properties and role in grain utilization. J Exp Bot, 2002, 53: 947–958.

[25] Chandra D, Cho K, Pham H A, Lee J Y, Han O. Down-regulation of rice glutelin by CRISPR-Cas9 gene editing decreases carbohydrate content and grain weight and modulates synthesis of seed storage proteins during seed maturation. Int J Mol Sci, 2023, 24: 16941.

[26] Kawakatsu T, Hirose S, Yasuda H, Takaiwa F. Reducing rice seed storage protein accumulation leads to changes in nutrient quality and storage organelle formation. Plant Physiol, 2010, 154: 1842–1854.

[27] Song D U, Jang M S, Kim H W, Yoon H J, Chay K O, Joo Y E, Jung Y D, Yang S Y, Ahn B W. Gastroprotective effects of glutinous rice extract against ethanol-, indomethacin-, and stress-induced ulcers in rats. Chonnam Med J, 2014,50: 6–14.

[28] Li Z T, Han S X, Pu J Y, Wang Y Y, Jiang Y, Gao M J, Zhan X B, Xu S. In vitro digestion and fecal fermentation of low-gluten rice and its effect on the gut microbiota. Foods, 2023, 12: 855.

[29] 车阳, 程爽, 田晋钰, 陶钰, 刘秋员, 邢志鹏, 窦志, 徐强, 胡雅杰, 郭保卫, 魏海燕, 高辉, 张洪程. 不同稻田综合种养模式下水稻产量形成特点及其稻米品质和经济效益差异. 作物学报, 2021, 47: 1953–1965.
Che Y, Cheng S, Tian J Y, Tao Y, Liu Q Y, Xing Z P, Dou Z, Xu Q, Hu Y J, Guo B W, Wei H Y, Gao H, Zhang H C. Characteristics and differences of rice yield, quality, and economic benefits under different modes of comprehensive planting-breeding in paddy fields. Acta Agron Sin, 2021, 47: 1953–1965 (in Chinese with English abstract).

[30] Li P, Chen Y H, Lu J, Zhang C Q, Liu Q Q, Li Q F. Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice. Rice, 2022, 15: 18.

[31] Yang Y H, Guo M, Sun S Y, Zou Y L, Yin S Y, Liu Y N, Tang S Z, Gu M H, Yang Z F, Yan C J. Natural variation of OsGluA2 is involved in grain protein content regulation in rice. Nat Commun, 2019, 10: 1949.

[32] Zhou S R, Yin L L, Xue H W. Functional genomics based understanding of rice endosperm development. Curr Opin Plant Biol, 2013, 16: 236–246.

[33] Biselli C, Bagnaresi P, Cavalluzzo D, Urso S, Desiderio F, Orasen G, Gianinetti A, Righettini F, Gennaro M, Perrini R, Ben Hassen M, Sacchi G A, Cattivelli L, Valè G. Deep sequencing transcriptional fingerprinting of rice kernels for dissecting grain quality traits. BMC Genomics, 2015, 16: 1091.

本文已在中国知网网络首发，网址：

https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240620.1748.004

期刊简介

《作物学报》是中国科学技术协会主管、中国作物学会和中国农业科学院作物科学研究所共同主办、科学出版社出版的有关作物科学的学术期刊。前身可追溯到1919年创办的《中华农学会丛刊》。主要刊载农作物遗传育种、耕作栽培、生理生化、种质资源以及与作物生产有关的生物技术、生物数学等学科具基础理论或实践应用性的原始研究论文、专题评述和研究简报等。《作物学报》从2001年起连续22年被中国科技信息研究所授予“百种中国杰出学术期刊”称号。2013年和2015年被国家新闻出版广电总局评为“百强科技期刊”, 2011年和2018年获“中国出版政府奖期刊奖提名奖”。据北京大学图书馆编著的《中文核心期刊要目总览》登载, 《作物学报》被列在“农学、农作物类核心期刊表”的首位。2019-2023年获中国科技期刊卓越行动计划梯队项目资助。2020年入选农林领域中国高质量科技期刊分级目录T1类。

敬请关注欢迎投稿

微信ID: zwxb66

投稿网址: http://zwxb.chinacrops.org/

作物学报

为本刊读者、作者、编委提供一个全方位的移动交流平台，实现移动查稿、移动审稿和移动阅读。