摘要 Abstract
油菜是我国第一大油料作物，每年提供的菜籽油占国产食用植物油的50%以上，在保障粮油安全战略中具有重要地位。选育适合机械化生产的理想株型油菜品种，提高油菜生产效益是当前油菜育种工作的重点内容。尽管在拟南芥、小麦、水稻和玉米等作物中的研究表明，GA合成和信号转导路径在植物株型建成中发挥重要作用[17-18]。然而，在异源多倍体甘蓝型油菜中开展的相关研究较少，GA合成和信号转导路径相关基因在油菜中的功能还有待系统研究。本研究对油菜SLY1基因进行了系统发育分析，通过CRISPR/Cas9技术创建BnaSLY1缺失突变体，并利用RNA-Seq技术对BnaSLY1在激素信号转导和其他生理过程中的作用进行系统研究，为探索GA信号转导路径在油菜生长发育中的重要作用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.2 SLY1生物信息学分析
1.3 DNA提取
1.4 RNA提取和荧光定量PCR分析(qRT-PCR)
1.5 亚细胞定位
1.6 CRISPR/Cas 9载体构建及遗传转化
1.7 转基因阳性植株鉴定和编辑情况检测
1.8 突变体表型观察
1.9 叶绿素含量测定
1.10 叶片组织结构观察
1.11 叶绿体超微结构观察
1.12 蜡质结构观察
1.13 内源赤霉素含量测定
1.14 转录组测序
1.15 数据分析
数据采用t检验(Student’s t-test)进行统计分析，利用GraphPad Prism 8.0绘制柱形图。
2 结果与分析
2.1 甘蓝型油菜BnaSLY1序列及进化分析
利用拟南芥AtSLY1核苷酸序列在BnIR数据库中进行blast发现，Westar中SLY1有2个同源拷贝BnaA01.SLY1和BnaA06.SLY1。其全长均为441 bp，仅含1个外显子，核苷酸序列相似性达97.5%，编码147个氨基酸，具有与拟南芥、白菜和甘蓝相同的F-box保守结构域(图1-A)。提取9个不同油菜品种基因组中的BnaSLY1基因序列进行多重比较发现，所有品种均包含2个同源拷贝，除Westar以外，其他8个品种的2个同源拷贝均分别位于A亚基因组A1 (BnaA01.SLY1)和C亚基因组C1染色体(BnaC01.SLY1)。Westar中BnaA06.SLY1与其他品种的BnaC01.SLY1聚类在一起(图1-B)，推测Westar在进化过程中发生了染色体交换和重组。不同品种间BnaA01.SLY1序列相似性在98.5%~100.0%，BnaC01.SLY1或BnaA06.SLY1序列相似性在98.2%~100.0% (附图1-微信略)，说明不同油菜品种间BnaSLY1高度相似，进化保守。对比单、双子叶20个不同物种的同源蛋白序列并构建系统进化树发现，SLY1蛋白聚在3个类群，I群中仅有大麻、高粱和水稻；绝大部分单子叶植物如小麦、水稻、玉米的SLY1聚集在II群；III群又细分为4个亚群，燕麦、苜蓿和芦笋等植物被聚类到了第一亚群，十字花科物种如白菜、甘蓝、油菜和拟南芥被聚类到第二亚群，双子叶植物被聚类到第三和第四亚群(图1-C)。Westar的SLY1与白菜和甘蓝中的氨基酸序列无差异，与AtSLY1仅有2%的差异。说明SLY1在十字花科物种中比较保守，是一个非常重要的功能基因。
图1 BnaSLY1的蛋白序列和SLY1进化分析
为研究BnaA01.SLY1和BnaA06.SLY1在甘蓝型油菜中的表达模式，取Westar的根、茎、叶、花、角果、角果皮和发育中的种子进行qRT-PCR检测，结果表明，BnaA01.SLY1和BnaA06.SLY1表达模式基本相同，在这些组织中均有较高表达，为组成型表达基因，且在叶片、花和角果中表达量最高(图2-A)。与BnIR数据库ZS11中BnaSLY1在不同组织内的表达特征结果相一致(图2-B)。构建BnaA01.SLY1和BnaA06.SLY1亚细胞定位载体在本氏烟草中瞬时表达，在激光共聚焦显微镜下观察荧光信号，发现融合蛋白的绿色荧光与细胞核的红色荧光重叠(图2-C)，说明BnaSLY1的2个拷贝均定位于细胞核。
图2 BnaSLY1表达特征
A: 不同拷贝BnaSLY1在Westar各组织中的相对表达量; B: BnaSLY1在ZS11各组织中的表达热图，表达数据为各基因TPM值，数据来源于BnIR数据库; C: BnaSLY1在本氏烟草中的亚细胞定位。标尺为25 μm。
2.3 BnaSLY1基因突变体的创建
为研究BnaSLY1在甘蓝型油菜中的功能，分别靶向BnaA01.SLY1、BnaA06.SLY1以及BnaA01.SLY1和BnaA06.SLY1构建了3个CRISPR/Cas9敲除载体并转化Westar (图3-A)。对转基因植株进行阳性鉴定，T0代共获得90株阳性苗，3个载体转基因阳性率为70.0%~81.8%。3个载体转基因T0代的编辑效率为57.1%~66.7%，基因双等位突变率为25.0%~41.7% (附表2-微信略)。在T1代挑取6个纯合突变株系进行后续研究，突变主要包括1~19个碱基的缺失，1~2个碱基的插入(图3-B)。
A: BnaSLY1基因结构和靶点位置; B: T1代BnaSLY1基因靶点突变情况。绿色字体表示PAM序列, 红色字体表示突变碱基, 红色虚线表示碱基缺失。
2.4 BnaSLY1基因敲除突变体表型鉴定
2.4.1 BnaSLY1影响叶色、开花时间以及株高
对T1代纯合突变体进行表型观察发现，在幼苗期，单突突变体bnaa01sly1和bnaa06sly1与对照Westar在表型上无明显差异，而双突突变体bnasly1幼苗匐地生长，叶柄变短，叶色呈深绿色且表皮光滑(图4-A，B)。调查开花时间发现，突变体开花时间都显著延迟(图4-C，D)。与Westar相比(46.5 d)，2个单突bnaa01sly1 (57.33 d)和bnaa06sly1 (54.46 d)初花期推迟8~12 d，双突bnasly1从播种到开花长达74.92 d，比单突进一步延迟。在成熟期，bnaa01sly1和bnaa06sly1株高比对照降低一半以上，而bnasly1株高比单突进一步降低，始终呈莲座状(图4-E)。说明BnaSLY1的2个拷贝BnaA01.SLY1与BnaA06.SLY1功能冗余，它们参与多个油菜生长发育过程，影响油菜的叶色、株高和开花时间等多个性状。
A: 对照Westar和突变体叶片表型; B: Westar和突变体苗期表型; C: Westar和突变体花期表型; D: Westar和突变体株高条形图; E: Westar和突变体开花时间条形图。标尺: 8 cm。**表示差异极显著(P < 0.01)。
2.4.2 BnaSLY1影响叶片细胞形态、叶绿素积累和表皮蜡质合成
对突变体和对照苗期最新展开叶进行组织切片观察以及叶绿素含量测定。石蜡切片结果显示，部分突变体叶片厚度显著高于野生型对照，其中bnaa01sly1叶片厚度是野生型的1.1~1.2倍，bnasly1的叶片厚度是野生型的1.2~1.4倍，而bnaa06sly1叶片厚度与野生型无显著差异。单突bnaa01sly1和双突bnasly1叶片变厚是由海绵组织细胞体积变大造成的(图5-A, C)。透射电镜观察结果表明，突变体和对照的叶绿体结构没有明显差异(图5-B)。叶绿素含量测定结果表明，单突bnaa01sly1和bnaa06sly1的叶绿素含量与对照相比没有显著差异，而双突bnasly1的叶绿素a含量是野生型的1.3~1.5倍，叶绿素总含量是野生型的1.5~1.6倍，均极显著高于野生型(图5-D)。
A: WT和突变体的叶片石蜡切片, 标尺为100 μm; B: WT和突变体叶绿体超微结构, 标尺为2 μm; C: WT和突变体叶片厚度统计; D: WT和突变体叶绿素含量比较。sm: 海绵组织; Cp: 叶绿体; Tm: 类囊体。*和**分别表示差异显著(P < 0.05)和极显著(P < 0.01); E: WT和突变体叶片表皮蜡质扫描电镜; 标尺为5 μm。
2.4.3 BnaSLY1影响油菜内源赤霉素含量
**表示差异极显著(P < 0.01)。
2.5 双突bnasly1油菜转录组测序分析
2.5.1 基因差异表达分析及富集分析
2.5.2 植物激素路径差异基因分析
a、b、c表示基因在Westar三个生物学重复中的log10(FPKM)值，d、e、f表示基因在bnasly1三个生物学重复中log10(FPKM)值，g表示Westar与突变体之间的log2FC。AUX1/IAA: 生长素/吲哚-3-乙酸；TIR1: 转运抑制响应蛋白；ARF: 生长素响应因子；SAUR: 生长素上调小RNA；GH3: 酰胺合成酶。
2.5.3 蜡质合成通路差异基因分析
共有60个差异基因富集在角质、次黄蜡质和蜡质生物合成途径，其中45个DEGs富集在蜡质合成通路(图8)，包括13个上调和32个下调基因。脂肪酸羟化酶基因BnaA03.CER3、转氨酶基因BnaC04.CER26和中链烷烃羟化酶基因BnaA02.MAH1在bnasly1中显著上调表达。6个脂酰辅酶还原酶(FAR)基因BnaFAR1、BnaFAR2、BnaFAR4和BnaFAR6在突变体中均显著下调表达。WSD1在拟南芥中催化酯类的生成，也是蜡质的重要组分[27]。8个BnaWSD1基因和6个酰基转移酶基因BnaGPAT6在突变体中均显著下调表达。12个编码羟化酶的P450家族基因也都发生了显著下调表达。说明BnaSLY1突变影响了蜡质的正常合成，从而导致叶片呈现光叶表型。
2.5.4 开花时间差异表达基因
与已报道的开花时间相关的DEGs有15个，其中8个在bnasly1中上调表达，7个下调表达(附表5-微信略)。8个开花时间负调控因子BnaSVPs、BnaTEM1s和BnaC03.FLC均出现了上调表达，在突变体中的表达量是野生型的2.37~6.41倍。成花基因BnaFT、BnaSPL、BnaTPR均在突变体中下调表达，仅为野生型的0.01~0.47倍。说明BnaSLY1通过转录调控开花时间基因的表达来影响油菜的开花期。
3 讨论
多种植物中的研究表明，生长素与GA合成和信号转导路径存在协同调控，一种激素关键基因的表达变化通常会影响另一种激素代谢路径的改变[36]。本研究证实，GA信号转导路径SLY1的突变导致生长素信号转导路径大量基因显著的表达变化，如生长素抑制因子基因BnaIAA2s、BnaIAA3s、BnaIAA17s和BnaIAA29s显著上调，这可能是导致bnasly1生长迟缓的原因。通过对突变体的表型鉴定、扫描电镜观察以及转录组测序发现，BnaSLY1的突变导致油菜叶片表皮蜡质合成发生显著变化，蜡质晶体结构改变且含量降低。植物角质层是由角质和蜡质组成的疏水屏障，形成了植物与外界环境的最外层接触区，具有重要的抗逆功能。烷烃是组成植物表皮蜡质的重要成分之一，FARs负责通过还原反应生成烷烃[37]。Westar中4个BnaFAR2同源基因均为高表达基因，而SLY1突变导致BnaFAR2s几乎不表达。细胞色素P450家族蛋白BnaCYP86B1和BnaCYP704B1编码脂肪酸ω-羟化酶，参与蜡质合成[38]，这些基因在Westar中高表达，而在bnasly1中几乎不表达。我们推测GA合成路径与蜡质合成也存在协调调控，BnaSLY1的突变间接导致蜡质合成路径的关键催化酶基因尤其是BnaFAR2、BnaCYP86B1和BnaCYP704B1等发生显著的下调表达，抑制了蜡质合成，导致光叶表型。
4 结论
参考文献
[1] Hedden P. The current status of research on gibberellin biosynthesis. Plant Cell Physiol, 2020, 61: 1832–1849.
[2] Yamaguchi S. Gibberellin metabolism and its regulation. Annu Rev Plant Biol, 2008, 59: 225–251.
[3] Hedden P, Phillips A L. Gibberellin metabolism: new insights revealed by the genes. Trends Plant Sci, 2000, 5: 523–530.
[4] Olszewski N, Sun T P, Gubler F. Gibberellin signaling. Plant Cell, 2002, 14: 61–80.
[5] Hedden P, Sponsel V. A century of gibberellin research. J Plant Growth Regul, 2015, 34: 740–760.
[6] Davière J M, Achard P. Gibberellin signaling in plants. Development, 2013, 140: 1147–1151.
[7] 李毅丹, 单晓辉. 赤霉素代谢调控与绿色革命. 生物技术通报, 2022, 38(2): 195–204.
Li Y D, Shan X H. Gibberellin metabolism regulation and green revolution. Biotechnol Bull, 2022, 38(2): 195–204 (in Chinese with English abstract).
[8] 董静, 尹梦回, 杨帆, 赵娟, 覃珊, 侯磊, 罗明, 裴炎, 肖月华. 棉花赤霉素不敏感矮化GID1同源基因的克隆和表达分析. 作物学报, 2009, 35(10): 1822–1830.
Dong J, Yin M H, Yang F, Zhao J, Qin S, Hou L, Luo M, Pei Y, Xiao Y H. Cloning and expression profiling of gibberellin insensitive dwarf GID1 homologous genes from cotton. Acta Agron Sin, 2009, 35: 1822–1830 (in Chinese with English abstract).
[9] Itoh H, Matsuoka M, Steber C M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci, 2003, 8: 492–497.
[10] Su S, Hong J, Chen X F, Zhang C Q, Chen M J, Luo Z J, Chang S W, Bai S X, Liang W Q, Liu Q Q, Zhang D B. Gibberellins orchestrate panicle architecture mediated by DELLA-KNOX signalling in rice. Plant Biotechnol J, 2021, 19: 2304–2318.
[11] Ito T, Okada K, Fukazawa J, Takahashi Y. DELLA-dependent and -independent gibberellin signaling. Plant Signal Behav, 2018, 13: e1445933.
[12] Sasaki A, Itoh H, Gomi K, Ueguchi-Tanaka M, Ishiyama K, Kobayashi M, Jeong D H, An G, Kitano H, Ashikari M, Matsuoka M. Accumulation of phosphorylated repressor for gibberellin signaling in an F-box mutant. Science, 2003, 299: 1896–1898.
[13] Dill A, Thomas S G, Hu J H, Steber C M, Sun T P. The Arabidopsis F-box protein SLEEPY1 targets gibberellin signaling repressors for gibberellin-induced degradation. Plant Cell, 2004, 16: 1392–1405.
[14] Gao S P, Chu C C. Gibberellin metabolism and signaling: targets for improving agronomic performance of crops. Plant Cell Physiol, 2020, 61: 1902–1911.
[15] Gomi K, Sasaki A, Itoh H, Ueguchi-Tanaka M, Ashikari M, Kitano H, Matsuoka M. GID2, an F-box subunit of the SCF E3 complex, specifically interacts with phosphorylated SLR1 protein and regulates the gibberellin-dependent degradation of SLR1 in rice. Plant J, 2004, 37: 626–634.
[16] El-Sharkawy I, Ismail A, Darwish A, El Kayal W, Subramanian J, Sherif S M. Functional characterization of a gibberellin F-box protein, PslSLY1, during plum fruit development. J Exp Bot, 2021, 72: 371–384.
[17] Peng J, Richards D E, Hartley N M, Murphy G P, Devos K M, Flintham J E, Beales J, Fish L J, Worland A J, Pelica F, Sudhakar D, Christou P, Snape J W, Gale M D, Harberd N P. ‘Green revolution’ genes encode mutant gibberellin response modulators. Nature, 1999, 400: 256–261.
[18] Ikeda A, Ueguchi-Tanaka M, Sonoda Y, Kitano H, Koshioka M, Futsuhara Y, Matsuoka M, Yamaguchi J. Slender rice, a constitutive gibberellin response mutant, is caused by a null mutation of the SLR1 gene, an ortholog of the height-regulating gene GAI/RGA/RHT/D8. Plant Cell, 2001, 13: 999–1010.
[19] Bujarrabal A, Schumacher B. Hormesis running hot and cold. Cell Cycle, 2016, 15: 3335–3336.
[20] Schmittgen T D, Livak K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc, 2008, 3: 1101–1108.
[21] Liu H, Chen W D, Li Y S, Sun L, Chai Y H, Chen H X, Nie H C, Huang C L. CRISPR/Cas9 technology and its utility for crop improvement. Int J Mol Sci, 2022, 23: 10442.
[22] Wang Y, Wu W H. Potassium transport and signaling in higher plants. Annu Rev Plant Biol, 2013, 64: 451–476.
[23] Liu Q, Wang C, Jiao X Z, Zhang H W, Song L L, Li Y X, Gao C X, Wang K J. Hi-TOM: a platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Sci China Life Sci, 2019, 62: 1–7.
[24] 何若韫. 叶绿素含量测定. 新农业, 1980, (3): 31–32.
He R Y. Chlorophyll content determination. New Agric, 1980, (3): 31–32 (in Chinese with English abstract).
[25] Cancé C, Martin-Arevalillo R, Boubekeur K, Dumas R. Auxin response factors are keys to the many auxin doors. New Phytol, 2022, 235: 402–419.
[26] 园园, 恩和巴雅尔, 齐艳华. 植物GH3基因家族生物学功能研究进展. 植物学报, 2023, 58: 770–782.
Yuan Y, En H B Y E, Qi Y H. Research advances in biological functions of GH3 gene family in plants. ChinBull Bot, 2023, 58: 770–782 (in Chinese with English abstract).
[27] 赵雪惠, 张蕊, 李玲, 付喜玲, 陈修德, 李冬梅, 肖伟, 高东升. 植物表皮蜡质合成及运输的研究进展. 植物生理学报, 2016, 52: 1128–1134.
Zhao X H, Zhang R, Li L, Fu X L, Chen X D, Li D M, Xiao W, Gao D S. Advances of plant cuticles biosynthesis and transport. Plant Physiol J, 2016, 52: 1128–1134 (in Chinese with English abstract).
[28] Birchler J A, Yang H. The multiple fates of gene duplications: deletion, hypofunctionalization, subfunctionalization, neofunctionalization, dosage balance constraints, and neutral variation. Plant Cell, 2022, 34: 2466–2474.
[29] Griffiths J, Murase K, Rieu I, Zentella R, Zhang Z L, Powers S J, Gong F, Phillips A L, Hedden P, Sun T P, Thomas S G. Genetic characterization and functional analysis of the GID1 gibberellin receptors in Arabidopsis. Plant Cell, 2006, 18: 3399–3414.
[30] Hirano K, Asano K, Tsuji H, Kawamura M, Mori H, Kitano H, Ueguchi-Tanaka M, Matsuoka M. Characterization of the molecular mechanism underlying gibberellin perception complex formation in rice. Plant Cell, 2010, 22: 2680–2696.
[31] Bao S, Hua C, Shen L, Yu H. New insights into gibberellin signaling in regulating flowering in Arabidopsis. J Integr Plant Biol, 2020, 62: 118–131.
[32] Olimpieri I, Caccia R, Picarella M E, Pucci A, Santangelo E, Soressi G P, Mazzucato A. Constitutive co-suppression of the GA 20-oxidase1 gene in tomato leads to severe defects in vegetative and reproductive development. Plant Sci, 2011, 180: 496–503.
[33] Willige B C, Ghosh S, Nill C, Zourelidou M, Dohmann E M N, Maier A, Schwechheimer C. The della domain of ga insensitive mediates the interaction with the ga insensitive dwarf1a gibberellin receptor of Arabidopsis. Plant Cell, 2007, 19: 1209–1220.
[34] Osnato M, Castillejo C, Matías-Hernández L, Pelaz S. TEMPRANILLO genes link photoperiod and gibberellin pathways to control flowering in Arabidopsis. Nat Commun, 2012, 3: 808.
[35] Mateos J L, Madrigal P, Tsuda K, Rawat V, Richter R, Romera-Branchat M, Fornara F, Schneeberger K, Krajewski P, Coupland G. Combinatorial activities of short vegetative phase and flowering locus c define distinct modes of flowering regulation in Arabidopsis. Genome Biol, 2015, 16: 31.
[36] Hu J, Su H L, Cao H, Wei H B, Fu X K, Jiang X M, Song Q, He X H, Xu C Z, Luo K M. AUXIN RESPONSE FACTOR7 integrates gibberellin and auxin signaling via interactions between DELLA and AUX/IAA proteins to regulate cambial activity in poplar. Plant Cell, 2022, 34: 2688–2707.
[37] Schneider-Belhaddad F, Kolattukudy P. Solubilization, partial purification, and characterization of a fatty aldehyde decarbonylase from a higher plant, Pisum sativum. Arch Biochem Biophys, 2000, 377: 341–349.
[38] Compagnon V, Diehl P, Benveniste I, Meyer D, Schaller H, Schreiber L, Franke R, Pinot F. CYP86B1 is required for very long chain omega-hydroxyacid and alpha, omega-dicarboxylic acid synthesis in root and seed suberin polyester. Plant Physiol, 2009, 150: 1831–1843.
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