亮点论文 | 不同CRISPR-Cas12f系统的编辑效率比较

学术三农 2024-07-14 10:10 北京

黄灵芝^1,2 符晓² 祁显涛² 刘昌林² 谢传晓² 吴鹏昊¹ 任姣姣^1,* 金洁^2,*

1 新疆农业大学农学院, 新疆乌鲁木齐 830052

2 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081

摘要 Abstract

来自Type Ⅴ-F家族的CRISPR/Cas12f蛋白报道仅为Cas9蛋白分子的1/4到1/3大小，在病毒载体的递送上具有重要优势。然而，CRISPR/Cas12f系统介导植物基因编辑的报道较少，编辑活性相对较低，限制了该系统在植物上的进一步应用。本研究分别在体外酶切、酵母以及玉米原生质体瞬时表达3个体系中比较了OsCas12f、SpCas12f及UnCas12f的编辑活性。结果表明，基于Cas12f/sgRNA的体外酶切，OsCas12f与SpCas12f蛋白的编辑活性相当，未检测到UnCas12f对底物酶切活性；在酵母突变eGFP的恢复表达试验中，OsCas12f在2个测试位点对eGFP蛋白的表达恢复效率达到95%以上，效率与Cas12i.3相当；SpCas12f介导的2位点eGFP蛋白表达恢复效率分别是1.63%与3.20%，效果次之；UnCas12f蛋白几乎无编辑活性；玉米原生质体瞬时表达比较OsCas12f和SpCas12f介导的玉米内源位点的编辑效率，发现OsCas12f对2个位点的编辑效率分别为2.72%和1.97%，而SpCas12f仅能介导其中1个位点的定点编辑，编辑效率为1.09%。Cas12f蛋白在靶位点处引入的突变类型以碱基的缺失为主，缺失碱基长度在−9~ −17 bp之间。综上，OsCas12f可以作为植物微型基因编辑器及衍生技术开发的底盘工具酶。

同行专家评语

开发超微型基因编辑系统是当前基因编辑技术发展的重要方向，该论文比较了3种不同来源Cas12f的编辑活性及相关优化技术，为拓展植物微型基因编辑工具特别是在玉米背景中的应用，提供了有较大应用潜力的参考信息。论文研究紧跟前沿技术热点，并具有一定的探索创新性，建议发表。

基因编辑是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术，通过人工构建工程化的序列特异性核酸酶，对基因组的目标区间序列进行特异性识别和定点剪切断裂DNA双链，细胞内源的非同源末端连接或同源重组修复在目标位点序列中产生碱基缺失、插入或替换等修饰[1]。基因编辑技术的发展大致经历了归巢核酸内切酶、锌指蛋白核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶以及成簇规律间隔短回文重复序列/邻近Cas基因(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein，CRISPR/Cas)系统4个阶段[2]。前3个阶段均以人工构建工程化蛋白为导向，后者基于RNA的配对识别目标DNA，具有简便性、灵活性和成本效益低的诸多优点，成为当前最受欢迎的基因组编辑工具[3]。

根据Cas蛋白组成和效应复合物的功能性质，CRISPR/Cas系统分为两大类，即Class1和Class2。其中，Class1系统的效应复合物由多个Cas蛋白亚基组成；而Class2系统的效应复合物则是单个多功能结构域蛋白[4]。另外，根据剪切模块的序列、功能特征及辅助模块的构成，Class1又分为3种类型即Type Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ，Class2分为Type Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ，且每个类型又分为了诸多不同的亚型[5]。目前，应用最广泛的基因编辑底盘工具酶均来自Class2系统，包括Type Ⅱ的Cas9和Type Ⅴ的Cas12a，两者的分子量大小、前间隔序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif, PAM)及剪切特征等均有不同。其中，效应蛋白的分子量大小与基因编辑工具的递送效率息息相关，分子量越小的Cas蛋白越容易通过病毒载体等进行递送，直接形成无转基因的目标突变体。因此，寻找分子尺寸更小的CRISPR效应核酸酶变得尤为重要。

许多分子量更小的Cas蛋白被陆续报道，例如SaCas9 (1053个氨基酸)[6]、CjCas9 (984个氨基酸)[7]、Cas12a (750~1373个氨基酸)[8]、Cas12b (1129个氨基酸)[9]、Cas12i (700~800个氨基酸)[10]、Cas12j (700~800个氨基酸)[11]、Cas9和Cas12a的祖先IscB (约400个氨基酸)[12]和TnpB (约550个氨基酸)[13]等。近期，一种微型的Cas12f蛋白被报道，其大小只有422~603个氨基酸，能够形成不对称二聚体，同sgRNA介导目标双链DNA的定点剪切[14]。当前已经报道的Cas12f系统有来自未培养古细菌(uncultured archaeon)的UnCas12f [15]、来自棕榈酸互营单胞菌(Syntrophomonas palmitatica)的SpCas12f [16]和来自颤螺菌属(Oscillibacter sp.)的OsCas12f [17]等，可介导细菌、人类、玉米和水稻的基因编辑[18]。然而，Cas12f蛋白对体系的离子浓度及温度的依赖性较高，编辑效率还有较大的提升空间。本研究通过PCR/RNP (Polymerase Chain Reaction / Ribonucleoprotein, PCR/RNP)体外酶切、酵母体内定向编辑和玉米原生质体瞬时表达编辑等体系，系统评估OsCas12f、SpCas12f及UnCas12f的定向编辑活性，旨在筛选出适合植物的微型高效Cas12f工具酶。

1 材料与方法

1.1 材料

将暗培养14 d的玉米品种B73的黄化苗用于制备原生质体。

1.2 菌株与质粒

大肠杆菌克隆菌株为Trans1-T1 (北京全式金生物技术有限公司，CD501)，原核表达菌株为BL21 (DE3) (北京全式金生物技术有限公司，CD601)，酵母转化菌株为AH109 (北京酷莱搏科技有限公司，CC317)。

原核表达载体pET-30a和酵母表达载体pGADT7和pGBKT7为本实验保存，克隆载体pEASY-Blunt 3购自全式金生物技术有限公司(CB301-01)；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，OsCas12f、SpCas12f和UnCas12f经玉米密码子优化后的全长编码序列及其sgRNA的骨架序列均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 试验方法

1.3.1 Cas12f原核表达载体、酵母表达载体及玉米原生质体瞬时表达载体的构建

原核表达载体构建：以人工合成的3个目的片段OsCas12f、SpCas12f和UnCas12f作为模板，利用带同源臂序列的引物进行PCR扩增(表1)，采用pET-30a载体作为目的载体，通过限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ在37℃酶切3 h后，通过NEBuilder DNA组装试剂盒(NEB北京分公司，E2621L)将pET-30a线性载体和不同Cas12f基因片段相连，最终成功构建pET-30a-OsCas12f、pET-30a-SpCas12f和pET-30a-UnCas12f载体。

酵母表达载体构建：根据目的载体序列来设计引物(表1)，扩增获得3种Cas12f、Cas12i.3片段。将pGADT7载体作为目的载体，通过限制性内切酶Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切获得线性载体。通过无缝克隆将扩增的目的片段与线性pGADT7载体相连，完成中间载体pGADT7-Cas12i.3、pGADT7-OsCas12f、pGADT7-SpCas12f、pGADT7-UnCas12f的构建；将中间载体利用Nhe Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶切割，与SNR52启动子序列和带有T1基因靶位点与T2基因靶位点的sgRNA序列(表1)相连，最终完成7个表达载体pGADT7-Cas12i.3-sgRNA、pGADT7-OsCas12f-T1、pGADT7-OsCas12f-T2、pGADT7-SpCas12f-T1、pGADT7-SpCas12f-T2、pGADT7-UnCas12f-T1、pGADT7-UnCas12f-T2的构建。

eGFP报告载体构建：将pGBKT7载体用BsaB Ⅰ与BssH Ⅱ进行双酶切，与带有T1、T2基因靶位点和eGFP序列目的片段(表1)相连，完成pGBKT7-eGFP报告载体的构建。

玉米原生质体表达载体构建：同上述方法一致，通过2次酶切和2次连接将扩增后的片段先后克隆至瞬时表达载体pUC19中，分别完成了pUC19-Ubi-OsCas12f-Rbcs、pUC19-Ubi-SpCas12f-Rbcs、pUC19-Ubi-OsCas12f-Rbcs-sgRNAT1、pUC19-Ubi-OsCas12f-Rbcs-sgRNAT2和pUC19-Ubi-SpCas12f-Rbcs-sgRNAT1和pUC19-Ubi-SpCas12f-Rbcs-sgRNAT2六个载体。在这6个表达载体中，由玉米Ubiquitin1启动子驱动Cas12f表达，用CaMV35S enhancer-CmYLCV-ZmU6复合型启动子驱动sgRNA表达^[19]。

1.3.2 不同Cas12f蛋白的原核表达及纯化

将不同Cas12f质粒转化到BL21 (DE3)感受态细胞中后挑取单克隆，最终在700 mL含有卡那抗生素(浓度均为50 µg mL^-1)的LB液体培养基37℃进行扩大培养到OD₆₀₀值在0.70~0.75区间，冰浴1 h，按1∶100加入0.5 mol L^-1 IPTG试剂进行诱导表达，恒温摇床培养温度18℃，转速为140转 min^-1，培养14~16 h。4000转 min^-1、4℃，离心20 min，收集菌体。加入45 mL结合缓冲液重悬菌体。超声波破碎菌体，12,000转 min^-1、4℃，离心1 h，取上清并过滤除菌。

细菌裂解液离心后按1∶1000比例加入清洗好过的Ni-NTA琼脂糖介质，4℃旋转孵育60~90 min。将样品通过收集柱经重力自然流出后，用20倍柱体积的清洗缓冲液清洗，之后用洗脱缓冲液进行洗脱，通过凝胶电泳(10% SDS-PAGE)对收集的各个组分进行鉴定。

利用100000-MWCO蛋白超滤管将样品中的洗脱缓冲液替换为蛋白储存液(50 mmol L^-1 Tris，600 mmol L^-1 NaCl，20% glycerol，1 mmol L^-1 TCEP (pH 7.5))直到样品浓缩体积为2 mL，并用Pierce M BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher，23227)对不同Cas12f蛋白进行定量。

1.3.3 RNA体外转录与纯化

分别在玉米ZmGDIa (Zm00001d010255)和ZmGRF5 (Zm00001d026240)基因上设计了靶向编辑位点T1：5′-TTC TGG GCA CGG GGC TCA AGG AGT GCA-3′和T2：5′-TTT CTT GAA CGG TTG CGG CCG CGG TGC A-3′，设计的靶位点适用于Cas12f在酵母及玉米原生质体中的活性检测。以合成的Cas12f的sgRNA骨架为模板，T7 sgRNA scaffold F、T1 sgRNA scaffold R、T2 sgRNA scaffold R为引物(表1)，通过重叠PCR将T7启动子及靶点序列分别添加到sgRNA序列的5′端和3′端，扩增获得不同Cas12f蛋白的sgRNA体外转录模板，2%琼脂糖凝胶电泳后胶回收，获得体外转录底物。体外转录使用HiScribeT7 RNA快速转录试剂盒(NEB，E2025S)。最后通过苯酚：氯仿萃取纯化和乙醇沉淀法获得sgRNA[20]，−80℃保存备用。

1.3.4 基于不同Cas12f蛋白的PCR/RNP酶切

以玉米B73基因组DNA为模板，通过PCR扩增sgRNA靶序列两侧各200~300 bp序列作为PCR/RNP酶切体系的底物。将2 µg不同Cas12f蛋白和2 µg sgRNA、1 µL 10×RNP组装缓冲液混合均匀，37℃孵育30 min，加入0.3 µg酶切底物，分别在28℃、37℃、45℃和55℃酶切0.5~3.0 h。加入2 µL RNaseA，37℃孵育15 min去除反应体系中的sgRNA，60℃孵育20 min终止反应，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况。采用ImageJ软件对酶切条带进行条带灰度值分析，酶切效率计算公式为：酶切效率(%) = (b+c)/(a+b+c) × 100%，式中，a为未消化PCR底物的灰度值，b和c为酶切产生条带的灰度值。

1.3.5 酵母细胞转化

取10 µL Carrier DNA，95~100℃，5 min，冰浴后快速冷却，重复1次。取100 µL AH109感受态冰上融化后依次快速加入构建完成的Cas12f酵母质粒2~5 µg、PEG/LiAc 500 µL充分吹打混匀，30℃水浴30 min，期间水浴至15 min时轻轻混匀1次。加入20 µL DMSO混匀，45℃水浴15 min (中间混匀1次)。5000转 min^-1离心40 s，弃上清，加入1 mL YPD Plus，30℃震荡培养90 min，5000转 min^-1离心40 s，弃上清，加入300 µL 0.9% NaCl重悬，均匀涂布在缺Trp (Tryptophan)和Leu (Leucine)的酵母培养基上，30℃倒置培养96 h。

试验设计组合方式：阳性对照载体pGADT7-Cas12i.3-sgRNA+pGBKT7-eGFP；OsCas12f编辑活性检测对照组pGADT7-OsCas12f+pGBKT7-eGFP，实验组pGADT7-OsCas12f-T1+pGBKT7-eGFP、pGADT7-OsCas12f-T2+pGBKT7-eGFP；SpCas12f编辑活性检测对照组pGADT7-SpCas12f+pGBKT7-eGFP，实验组pGADT7-SpCas12f-T1+pGBKT7-eGFP、pGADT7-SpCas12f-T2+pGBKT7-eGFP；UnCas12f编辑活性检测对照组pGADT7-UnCas12f+pGBKT7-eGFP，实验组pGADT7-UnCas12f-T1+pGBKT7-eGFP、pGADT7-UnCas12f-T2+pGBKT7-eGFP。

酵母绿色荧光蛋白恢复表达观察：利用LUYOR-3415RG便携式荧光蛋白激发光源对酵母克隆进行eGFP表达的可视化检测。酵母中eGFP恢复效率的计算公式：eGFP恢复效率(%) = (绿色荧光酵母克隆数/统计酵母克隆数) × 100%。

1.3.6 玉米原生质转化及突变位点检测

玉米原生质体制备及PEG介导的玉米原生质体转化方法参考Cao的文章[21]。分别取不同Cas12f表达质粒20 μg，通过PEG转化至玉米原生质体中，暗培养48 h后收集原生质体，CTAB方法提取原生质体基因组DNA，利用靶位点特异扩增引物(表1)进行PCR扩增后进行Hi-TOM测序，检测靶位点编辑情况。

2 结果与分析

2.1 OsCas12f、SpCas12f、UnCas12f蛋白的原核表达纯化

基于原核表达骨架载体pET-30a，构建了OsCas12f、SpCas12f和UnCas12f蛋白的原核表达载体(图1-A)。分别在蛋白两端融合了6×His标签，融合标签后OsCas12f、SpCas12f及UnCas12f蛋白分子量大小预测分别为62.93 kD、70.41 kD和75.12 kD。研究分别在28℃和37℃下进行IPTG诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测表明，Cas12f蛋白均有表达，且表达蛋白大小符合预期(图1-B)。研究进一步扩大诱导表达体系，为保持蛋白活性，蛋白诱导表达温度调整为18℃，利用Ni-NTA亲合层析柱进行蛋白纯化，获得较高纯度的Cas12f蛋白(图1-C)，用于后续体外PCR-RNP活性检测。

图1 不同CRISPR-Cas12f蛋白的原核表达及蛋白纯化

A：CRISPR-Cas12f原核表达载体结构示意图；B：3种CRISPR-Cas12f蛋白在28℃和37℃下的诱导表达；C：3种CRISPR-Cas12f蛋白Ni-NTA纯化后12% SDS-PAGE凝胶电泳图。

2.2 Cas12f/sgRNA介导的体外底物酶切

将OsCas12f、SpCas12f和UnCas12f纯化蛋白分别与sgRNA-T1、sgRNA-T2组装为RNP复合体，对2种PCR产物进行酶切，结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，以验证不同Cas12f蛋白的底物酶切活性。研究比较了反应温度为28℃、37℃、45℃和55℃时不同Cas12f蛋白对底物的酶切效率。结果显示，28℃时OsCas12f和SpCas12对靶点T1酶切效率分别为45%和44%；37℃时OsCas12f和SpCas12对靶点T1酶切效率分别为73%和87%，对靶点T2酶切效率分别为20%和10%；45℃时OsCas12f和SpCas12对靶点T1酶切效率分别为81%和85%，对靶点T2酶切效率分别为86%和46%；55℃时OsCas12f和SpCas12对靶点T1酶切效率分别为49%和96%，对靶点T2酶切效率分别为45%和78%。其中，OsCas12f的最佳温度为45℃，SpCas12f的最佳温度为55℃。28℃时OsCas12f和SpCas12f对靶点T2序列无剪切活性。所有测试温度下UnCas12f均不能对底物进行剪切(图2)。

图2 3种CRISPR-Cas12f蛋白在不同温度下的底物酶切效率

A：28℃时Cas12f的PCR/RNP酶切效率；B：37℃时Cas12f的PCR/RNP酶切效率；C：45℃时Cas12f的PCR/RNP酶切效率；D：55℃时Cas12f的PCR/RNP酶切效率。

研究进一步测试了反应温度为45℃，不同反应时间Cas12f蛋白对底物的剪切效率。结果表明，0.5 h时OsCas12f和SpCas12对靶点T1剪切效率分别为49%和47%，对靶点T2剪切效率分别为79%和18%；1 h时OsCas12f和SpCas12对靶点T1剪切效率分别为70%和61%，对靶点T2剪切效率分别为81%和82%；2 h时OsCas12f和SpCas12对靶点T1剪切效率分别为72%和78%，对靶点T2剪切效率分别为81%和34%；3 h时OsCas12f和SpCas12对靶点T1剪切效率分别为64%和84%，对靶点T2剪切效率分别为85%和49%。其中，酶切1 h，OsCas12f对靶点T1和T2的酶切效率最大，而3 h时SpCas12f对靶点T1和T2的酶切效率最大。UnCas12f在延长酶切时间的条件下仍没有酶切活性(图3)。

图3 3种CRISPR-Cas12f蛋白在不同时间下底物酶切效率

A：Cas12f在0.5 h时PCR/RNP酶切效率；B：Cas12f在1 h时PCR/RNP酶切效率；C：Cas12f在2 h时PCR/RNP酶切效率；D：Cas12f在3 h时PCR/RNP酶切效率。

2.3 CRISPR/Cas12蛋白在酵母体系中活性检测

为比较不同CRISPR-Cas12f系统的真核生物基因编辑活性，构建了基于荧光蛋白表达恢复的Cas12f蛋白编辑活性报告系统。然后分别构建仅Cas12f蛋白表达和Cas12f与向导sgRNA分子同时表达的编辑载体(图4-A)。将报告载体与编辑载体共转化酵母后，Cas12f蛋白在靶位点剪切产生DNA双链断裂，通过同源重组修复可恢复eGFP蛋白的表达(图4-B)。

图4 3种CRISPR-Cas12f系统的酵母编辑效率

A：酵母转化载体示意图；B：通过荧光蛋白恢复率评估CRISPR-Cas12f系统编辑效率原理图；C：不同CRISPR-Cas12f介导的酵母eGFP恢复效率统计。

将OsCas12f、SpCas12f及UnCas12f携带或不携带靶向T1或T2 sgRNA表达载体同报告载体共转化酵母涂SD/-Leu/-Trp双缺板，28℃培养48 h后统计eGFP蛋白表达恢复率。结果显示，Cas12i.3系统能够高效恢复eGFP的表达，荧光蛋白的恢复效率达97.28%。OsCas12f同sgRNA-T1、sgRNA-T2对eGFP的表达恢复效率分别是97.60%与95.67%；SpCas12f同sgRNA-T1、sgRNA-T2对eGFP的表达恢复效率分别是1.63%与3.20%；UnCas12f组合对eGFP的表达恢复效率分别0.24%与0.16%，基本为背景表达水平(图4-C和图5)。研究结果表明，OsCas12f在酵母细胞内的编辑活性跟Cas12i.3相当，SpCas12f在酵母细胞内的编辑活性较低，而UnCas12f几乎没有编辑活性。

图5 OsCas12f系统介导的eGFP表达恢复

A：Cas12i.3介导的eGFP表达恢复，为阳性对照；B：无sgRNA不能介导OsCas12f系统恢复eGFP；C：sgRNA-T1介导OsCas12f系统恢复eGFP；D：sgRNA-T2介导OsCas12f系统恢复eGFP。

2.4 CRISPR/Cas12蛋白在玉米原生质体中的活性检测

前人研究证明SpCas12f在玉米和水稻中具有编辑活性[14]，本研究发现OsCas12f在体外及酵母胞内具有优于SpCas12f的靶标编辑活性。因此，研究进一步评估OsCas12f同SpCas12f在玉米原生质体瞬时表达的编辑活性。研究分别构建了靶向玉米内源T1、T2位点的OsCas12f或SpCas12f植物表达载体，利用转录增强子串联玉米的Ubiquitin1启动子驱动OsCas12f或SpCas12f的表达和CaMV35s enhancer-CmYLCV-ZmU6复合型启动子驱动向导RNA的表达。瞬时转化玉米原生质体后置于37℃培养48 h，提取基因组DNA，扩增靶位点序列进行二代测序。

Hi-TOM测序结果分析表明，OsCas12f在靶向位点T1和T2均可以进行定点编辑引入缺失突变，在内源位点T1的编辑效率为2.72%，在靶位点远离PAM端发生9 bp到14 bp不等的碱基缺失，在内源位点T2的编辑效率为1.97%，在远离PAM端的靶位点处发生11 bp的碱基缺失。SpCas12f在T1靶位点没有检测到突变，在T2靶位点处检测到17 bp的插入缺失突变，编辑效率仅为1.09% (表2)。结果表明，OsCas12f蛋白的玉米原生质体瞬时表达编辑活性高于SpCas12f。

3 讨论

由于Cas12f蛋白分子量小，V-F型的CRISPR-Cas12f系统在编辑工具的递送环节具有较大的优势，是基因编辑应用领域的重要潜力工具。本研究检测了OsCas12f、SpCas12f和UnCas12f分别在体外酶切、酵母以及玉米原生质体瞬时表达等对靶位点的编辑活性。结果表明，OsCas12f和SpCas12f在体外对底物PCR-RNP的酶切能力基本相当，但OsCas12f的最佳适宜温度要求相对SpCas12f低，OsCas12f的最佳适宜温度为45℃，SpCas12f的最佳适宜温度为55℃；酶切反应速度上，OsCas12f对底物实现最大酶切大约1 h，而SpCas12f基本需要3 h；总体上，OsCas12f优于SpCas12f。由此，更好的解释了酵母体内靶位点的编辑活性表现。OsCas12f介导的荧光蛋白表达恢复效率远高于SpCas12f和UnCas12f，其对靶位点的编辑效率与Cas12i.3相当。在本研究中的体外酶切和酵母体系中均未检测UnCas12f的底物编辑活性，Karvelis等[22]研究比较了不同Cas12f核酸酶介导的大肠杆菌中质粒干扰活性，比较发现Un1Cas12f1、Un2Cas12f2和AuCas12f2等均不具备质粒干扰活性，SpCas12f1具有较强的质粒干扰活性。

前人的研究表明SpCas12f的最适温度较高，需要热激活或者较高的培养温度才能获得SpCas12f介导的玉米或水稻稳定表达株系靶位点的定向编辑[21,23-24]。本研究中瞬时表达Cas12f蛋白介导的玉米内源靶位点编辑活性比较证明，OsCas12f介导了两个靶位点的定向编辑，造成远离PAM端的不同类型的多碱基缺失，突变类型符合该家族蛋白的编辑特征；而SpCas12f蛋白仅在其中的1个靶位点检测到1种突变类型。本研究系统的比较了3种Cas12f的靶向编辑活性，证明了OsCas12f较SpCas12f和UnCas12f具有更高效的编辑活性，未来其在稳定转化株系中的编辑活性可能不需要热激活等额外操作。此外，OsCas12f酶的小尺寸和自二聚化[25]将为基于病毒的植物转基因递送提供可能。

4 结论

本研究通过体外酶切、酵母以及玉米原生质体3种方式综合评估了OsCas12f、SpCas12f和UnCas12f的编辑活性，发现OsCas12f和SpCas12f在体外具有同等的底物酶切能力，尤其是OsCas12f，其最适反应温度较SpCas12f低，且酶切反应速度较快。在酵母中，OsCas12f对底物的编辑能力与已报道的Cas12i.3蛋白相当。最后，在玉米原生质体的瞬时表达编辑活性上，OsCas12f的编辑效率高于SpCas12f。因此，微型OsCas12f系统在植物基因编辑中具有较大的应用潜力。

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本研究由国家重点研发计划项目(2023YFD1202901)资助。

^*通信作者: 任姣姣, E-mail: renjiaojiao789@sina.com; 朱金洁, E-mail: zhujinjie@caas.cn

第一作者联系方式：E-mail: 1993253522@qq.com

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期刊简介

《作物学报》是中国科学技术协会主管、中国作物学会和中国农业科学院作物科学研究所共同主办、科学出版社出版的有关作物科学的学术期刊。前身可追溯到1919年创办的《中华农学会丛刊》。主要刊载农作物遗传育种、耕作栽培、生理生化、种质资源以及与作物生产有关的生物技术、生物数学等学科具基础理论或实践应用性的原始研究论文、专题评述和研究简报等。《作物学报》从2001年起连续22年被中国科技信息研究所授予“百种中国杰出学术期刊”称号。2013年和2015年被国家新闻出版广电总局评为“百强科技期刊”, 2011年和2018年获“中国出版政府奖期刊奖提名奖”。据北京大学图书馆编著的《中文核心期刊要目总览》登载, 《作物学报》被列在“农学、农作物类核心期刊表”的首位。2019-2023年获中国科技期刊卓越行动计划梯队项目资助。2020年入选农林领域中国高质量科技期刊分级目录T1类。

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