亮点论文 | 陆地棉CLE基因家族的鉴定及GhCLE13参与调控棉花抗旱性的功能分析

学术三农 2024-09-09 14:02 北京

戎宇轩^** 惠留洋^** 王沛琦孙思敏张献龙袁道军^* 杨细燕

华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室/ 湖北洪山实验室，湖北武汉 430070

摘要 Abstract

CLAVATA3/Embryo surrounding region-related (CLE)小肽家族是植物中最大的小肽激素家族，在植物中广泛存在，且参与植物多个重要的生命活动。本研究对陆地棉CLE基因家族进行了鉴定，并对GhCLE基因家族成员进行基因结构、启动子顺式作用元件、蛋白质理化性质、系统发育的分析；通过RNA-seq数据构建了GhCLE基因家族成员在陆地棉各组织的表达谱及干旱处理下的表达模式，并筛选在棉花根系特异表达且受干旱诱导的CLE基因；最后通过VIGS技术对筛选出的GhCLE基因进行了抗旱功能的验证。结果显示，在陆地棉全基因组共鉴定出40个GhCLE基因，GhCLE基因结构较为简单，32个GhCLE基因没有内含子，所有基因编码的蛋白序列均包含12 aa长度的CLE结构域；GhCLE基因启动子区域包含多种光诱导响应、胁迫响应、激素响应和发育相关的顺式作用元件；GhCLE基因在陆地棉多个组织均有表达，筛选出了1个根系特异表达且受干旱诱导的GhCLE13-D-2基因。通过VIGS技术和MDA含量的测定和比较验证了GhCLE13-D-2基因提高棉花的抗旱性的功能。本研究为CLE小肽在植物抗逆方面的深入研究以及棉花种质创新提供了新的理论依据。

同行专家评语

本文通过生物信息学手段研究了植物中一类重要的小肽家族并筛选出棉花抗旱基因GhCLE13。文字摘要、研究方法、研究结果和论述逻辑合理、表述清晰，具有一定的创新性和参考价值。

植物小肽激素，又称为“小分子信号肽”，是由植物自身合成、长度通常小于100个氨基酸、具有特殊功能且结构简单的成熟多肽分子，是一类重要的植物生长调节物质[1]。小肽激素在植物体内浓度极低(飞摩尔级浓度)，但仍能以配体的形式与细胞膜表面的受体激酶结合并相互作用，进行细胞间信号的传导，完成对植物生长、发育、繁殖、抗逆等过程的调控[2]。近年来，随着基因组学、转录组学、遗传学及肽组学的发展，研究人员对植物小肽的结构、分类、功能以及其在植物生长发育调节功能已有一定的研究，但对于植物小肽的研究还处于初步阶段。自1991年系统素(Systemin, SYS)发现以来，已有数十种小肽激素在不同植物中被鉴定到。SYS是在植物中发现的第1个小肽激素，其成熟肽链由18个氨基酸组成，主要是通过激活蛋白酶抑制剂基因的表达参与调节番茄抗虫的防御反应和机械损伤的修复[3]；植物磺化肽激素(phytosulfokine, PSK)参与植物花粉管生长、体细胞胚胎发生、棉花纤维发育等过程[4-6]；快速碱化因子(rapid alkalinization factor, RALF)是植物中广泛存在的富含半胱氨酸的小肽，其能被一些类受体激酶识别，进而调控植物根系发育、生殖发育及逆境调控[7-9]。

CLE (CLAVATA3/Embryo surrounding region-related)家族是植物中最大的小肽激素家族，目前在模式植物拟南芥中已经鉴定到至少31个CLE小肽家族成员，多肽链长度在74~124个氨基酸，N端有一段信号肽序列(signal peptide，SP)，C端包含一段12个氨基酸长度且较为保守的CLE结构域[10]。CLE家族基因几乎在拟南芥各个组织都有表达，并参与多个重要的生长发育过程，如CLAVATA3 (CLV3)基因在茎尖分生组织(shoot apical meristem, SAM)区基部的细胞内表达，与细胞膜上CLV1/CLV2受体复合物结合将CLV3信号传递到SAM中央区抑制WUSCHEL(WUS)基因的表达，最终抑制SAM区的过度增殖，维持分生组织的稳定以及分生干细胞的活性[11]；由CLE基因编码的导管分化抑制因子(tracheary element differentiation inhibitory factor, TDIF)参与调节植物水分运输组织的形成和发育[12]；CLE小肽激素在作物的生长发育和逆境响应过程中也发挥着重要的作用。在玉米中，利用基因编辑技术，对CLV3基因的启动子区域进行编辑，特异性降低了该基因在玉米分生组织的表达水平，导致玉米花序分生组织增大，且单个玉米的穗行数显著增加，进一步提升了玉米的单穗产量[13]。在油菜中，华中农业大学范楚川团队利用基因编辑技术成功敲除了BnCLV3基因，BnCLV3基因的双突变植株表现为叶片增多，每个角果的种子粒数提高和种子重量增加，因而具有很高的增产潜力[14]。研究发现，寄生在植物根部的囊状线虫，可以分泌类似于寄主CLE多肽的效应蛋白，通过沉默植物体中的CLE多肽受体，可降低囊状线虫对植物体的侵害[15]。部分CLE小肽在植物干旱胁迫响应过程中发挥着重要作用。如拟南芥植株受到干旱后，根部的AtCLE25被激活表达，小肽激素通过维管运输到叶片与BAM受体结合，促进类胡萝卜素双加氧酶NCED3基因的表达，催化ABA前体分子的形成，诱导气孔关闭，降低植物体内水分蒸腾速率，协助其应对干旱胁迫[16]。

棉花是锦葵科棉属植物，是世界上最重要的经济作物之一，是关系到国民经济发展的特殊商品和重要战略物资，也是纺织工业所需天然纤维的重要来源。然而，随着生长环境的不断恶化，棉花主产区常常遭受着干旱、盐碱和低温等多种极端环境，严重影响了棉花的生长发育和产量[17]。解决干旱胁迫问题已成为最重大的难题之一[18]。因此，挖掘调控棉花抗旱的位点、培育抗旱性优良的棉花种质是重要的育种目标之一。

如前文所述，CLE小肽激素参与植物多种抗逆过程[16]。袁娜等[19]在2018年对棉属中二倍体棉种A₁、A₂、D₅基因组和四倍体棉种AD₁、AD₂基因组对CLE基因家族成员进行全基因组鉴定，共鉴定到148个CLE基因，其中在陆地棉中鉴定到49个CLE基因；此外，高梦涛[20]也对棉属CLE基因家族进行了鉴定，其中在陆地棉全基因组鉴定到41个已注释的小肽基因，并对陆地棉GhCLE5基因调控拟南芥SAM的功能机制进行了研究。但目前为止，CLE基因是否参与调控棉花抗旱的生物学功能尚未见报道。本研究基于我们发布的陆地棉参考基因组[21]，对陆地棉CLE基因家族成员进行了鉴定，鉴定到40个包含信号肽序列的分泌型CLE小肽编码基因；通过RNA-seq分析筛选出可能参与调控棉花抗旱的、根系特异表达的成员GhCLE13-D-2，并通过VIGS技术对其参与调控棉花抗旱的生物学功能进行验证。本研究为CLE小肽在植物抗逆方面的深入研究以及棉花种质创新提供了新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料和试验所需材料

陆地棉Jin 668种子由本实验室保留。播种后，棉花在23℃(黑暗)/28℃(光照)温室中生长，光照16 h/黑暗8 h。

1.2 GhCLE基因家族的鉴定

以拟南芥的32个CLE小肽氨基酸序列(提取自拟南芥TAIR10数据库，https://www. arabidopsis.org/)为查询序列[22]，利用NCBI (National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的本地BLASTp [23]软件在陆地棉基因组中进行比对，阈值设置为：E-value≤1e-10，bitscore≥70，identity≥70 [20]。根据GeneID在参考基因中将基因位置、转录本全长序列、CDS序列、氨基酸序列等信息提取出来，并将所有基因的氨基酸序列分别提交到在线软件MEME Suite [24] (https://meme-suite.org/)和SignalP5.0 [25](https://services. healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)网站进行结构域和信号肽的预测，去除不含C-端CLE基序和N-端信号肽的序列，最终确定CLE基因家族成员。

1.3 GhCLE序列结构、启动子顺式作用元件以及蛋白理化性质分析

在陆地棉基因组的GFF注释文件中提取GhCLE基因家族的注释信息，并将全部CLE的蛋白序列提交到MEME Suit [24] (https://meme-suite.org/)上重新预测结构域，保存XML文件；利用perl脚本stat_protein_fa.pl [26](附表1-微信略)计算GhCLE家族成员蛋白的理化性质。

提取每条基因上游2 kb的核苷酸序列作为启动子区域，将提取出来的启动子序列提交到PlantCare (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行顺式作用元件的预测，最后用TBtools [27]软件可视化基因结构、保守结构域和顺式作用元件。

1.4 GhCLE基因家族进化分析

将鉴定到的GhCLE基因和31条AtCLE基因对应的蛋白序列合并到一个fasta序列文件中，使用ClustaW软件进行多序列比对，使用iq-tree [28]软件最大似然法构建进化树，Bootstrap值为1000次，将得到的进化树文件用Evolview [29]软件(http://www.evolgenius.info/evolview/)进行进化树的绘制和美化。

1.5 GhCLE基因多组织和不同水分处理下根系的表达图谱构建

转录组数据收集自NCBI公共数据库的陆地棉根、茎、叶片、雌蕊、雄蕊、花瓣和花托等组织(附表2-微信略)，以及课题组前期研究测序的不同水分处理的陆地棉根系转录组数据。对数据进行质控和过滤，使用Hisat2 [30]和Stringtie [31]软件进行参考基因组的比对和转录本及定量，将GhCLE基因家族成员的表达量从转录本中提取出来，用MAX-MIN方法进行均一化处理，使用ggplot2 [32]软件绘制GhCLE基因家族在根、茎、叶、花托、花瓣、雄蕊和雌蕊等组织中的表达量热图。

1.6 根系特异表达GhCLE基因的功能验证

为验证GhCLE基因在棉花根系抗干旱胁迫的功能，本研究首先利用公共数据库下载的棉花各组织的转录组数据及课题组前期抗旱研究产生的根系转录组来进行基因表达分析，以FPKM作为表达量数据，在40个CLE基因家族成员中选取了1个同时满足根系特异表达且在干旱条件下上调表达的基因GhCLE13-D-2 (Ghir_D13G007160)作为候选基因，预测该基因可能参与了棉花的根系抗旱过程。该基因在棉花基因组中存在2个同源基因，分别为GhCLE13-A (Ghir_A11G000690)和GhCLE13-D-1 (Ghir_D11G000720)，但这2个同源基因在棉花根部均无表达。为了验证我们的预测，在GhCLE13-D-2基因CDS序列中选取特异片段设计基因克隆和载体构建的引物(附表3-微信略)，并克隆该基因和构建VIGS基因沉默载体TRV2::GhCLE13-D-2。选用陆地棉Jin668品种作为试验材料(本课题组提供)，转化所用的农杆菌菌株为GV3101。

将含有TRV1的农杆菌分别与含有TRV2::GhCLE13-D-2、TRV2::GhCLA和TRV2的农杆菌1∶1混合(OD₆₀₀=0.8)。菌液注射至棉花幼苗的子叶，遮光处理24 h，待TRV2::GhCLA株系出现稳定的白化表型时，利用RT-qPCR检测TRV2::GhCLE13-D-2株系中目的基因的沉默效率。干旱处理10 d后，观察叶片的萎蔫程度并进行比较。1.7 MDA含量的测定

丙二醛(malonaldehyde, MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生会进一步加剧细胞膜的损伤，其含量的多少与膜脂过氧化程度的高低密切相关，通过MDA含量可间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性[33]。为了比较GhCLE13-D-2基因沉默株系和对照组叶片MDA含量，在干旱处理2周后，从正常水份处理组和干旱处理组的TRV2::GhCLE13和TRV2::00株系分别选取3株长势相当的植株上各取1片叶片，迅速放置于液氮中速冻。从液氮中取出样品，放研钵中研磨成粉末，取0.1 g放入2 mL离心管中，加入1 mL提取液，进行冰浴匀浆，然后放置离心机中，4℃、1223×g离心10 min，离心后取上清液200 μL至新的离心管，再加入300 μL工作液，95℃水浴30 min，期间打开酶标仪预热。将样品从水浴锅中取出后置冰上冷却5 min，再次加入离心机，25℃、1223×g离心10 min，最后分别在每个样本中取200 μL上清液至96孔酶标板，分别在酶标仪中532 nm和600 nm处读取吸光度值，并按照MDA含量(nmol g^-¹)=32.3×(532 nm吸光度-600 nm吸光度)/0.1 g的公式进行计算。试验设置3个生物学重复，用t检验方法进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 GhCLE基因家族的鉴定

以拟南芥的AtCLE基因氨基酸序列为种子序列，经过BLAST比对、保守结构域分析和信号肽预测，去除不包含C-端保守结构域和N-端信号肽的序列，最终共鉴定到40个陆地棉GhCLE基因家族成员，蛋白质理化性质分析结果得出，除一条含多个CLE motif的序列长度为306个氨基酸外，其余多肽序列长度在74~131个氨基酸(表1)。

2.2 GhCLE基因序列结构、启动子顺式作用元件以及蛋白理化性质分析

基因结构特征分析显示，GhCLE基因家族中32个基因不包含内含子，仅8个基因包含内含子；32个基因包含3' UTR和5' UTR，1个基因包含5' UTR不包含3' UTR，2个基因包含3' UTR不包含5' UTR，5个基因既不包含3' UTR也不包含5' UTR (图1-A)。

采用MEME软件在线预测的蛋白质结构域发现，每个基因的N-端和C-都分别包含信号肽序列(Signal peptide: LLJLJLLLLLSJQASRRNVLI) (图1-B)和CLE保守结构域序列(CLE motif: RRVPTGPBPLHN) (图1-C)，其中有GhCLE1-D-3基因的C-端包含了8个CLE motif。

图1 GhCLE基因家族基因结构、氨基酸列保守结构域以及顺式作用元件分析

A：GhCLE基因家族成员基因结构和结构域示意图；B：GhCLE基因家族保守信号肽结构域示意图；C：GhCLE基因家族保守CLE motif示意图。

蛋白质理化性质分析显示(表1)，GhCLE基因家族蛋白最大分子量为32.5428 kD，最小分子量为8.767 kD。最高等电点为12.42，最低等电点为5.03，大部分GhCLE基因家族成员等电点大于7，说明GhCLE家族蛋白偏碱性。

通过对40个GhCLE基因的启动子区域顺式作用元件分析显示，GhCLE基因家族顺式作用元件众多，我们将其分为植物激素响应元件、胁迫响应元件、生长发育调控元件和光响应元件。其中，植物激素响应元件包含赤霉素、脱落酸、生长素、水杨酸和茉莉酸响应元件，说明GhCLE基因家族的表达可能与与植物体内各种激素的含量相关联；胁迫响应元件包含了低温胁迫响应、厌氧诱导、干旱胁迫响应和损伤响应，说明GhCLE基因家族可能参与了棉花多个抗胁迫的生理过程；生长发育调控元件包含了分生组织表达调控元件和生物节律调控元件，说明了GhCLE基因家族成员可能参与了棉花的分生组织发育，同时对棉花生长过程中的生物节律调控起着重要的作用；GhCLE基因家族每个成员的启动子区域都包含光响应元件，说明GhCLE基因家族成员的表达普遍受到了光的调控(图2)。

图2 顺式作用元件分布示意图

2.3 GhCLE基因家族系统发育分析

为研究陆地棉CLE基因家族的进化关系，以拟南芥CLE基因家族研究作为参考，构建了GhCLE基因家族的进化树(图3-A)。CLE motif是CLE基因发挥功能的核心结构域，序列不相同的CLE基因可能发挥着不同的作用，根据其motif序列的不同，将陆地棉CLE基因家族分为了4个亚组(Group 1~Group 4) (图3-B)。其中，Group 1亚组中的成员CLE motif的第8位和第12位氨基酸分别较为保守的为D (Asp，天冬氨酸)和H (His，组氨酸)；Group 2亚组中的成员CLE motif的第8位和第12位氨基酸分别较为保守的为D (Asp，天冬氨酸)和N (Asn，天冬酰胺)；Group 3和Group 4亚组中的成员CLE motif的第8位和第12位氨基酸较为保守均为N (Asn，天冬酰胺)，但Group 3和Group 4的CLE motif的第2位有着不同的氨基酸使用偏好性，分别为L (Leu，亮氨酸)、E (Glu，谷氨酸)、T (Thr，苏氨酸)和R (Arg，精氨酸)、K (Lys，赖氨酸)、V (Val，缬氨酸)，理化性质不同的氨基酸可能会使其产生的功能的差异。

图3 GhCLE基因家族系统发育分析及聚类

A：GhCLE基因家族系统进化树；B：GhCLE基因家族各亚家族CLEmotif特征示意图。

2.4 GhCLE家族基因组织表达谱的构建以及抗旱功能基因的筛选

GhCLE基因家族在根、茎、叶、花托、花瓣、雄蕊、雌蕊组织中的表达量热图如图4-A。通过分析发现，GhCLE基因家族在所有组织中表达量普遍较低，这符合小肽基因表达的特点。通过观察表达量热图发现，各个组织都存在特异表达的CLE基因，如：在根部特异表达的有GhCLE14-A-2、GhCLE13-D-2和GhCLE25-D-1；在茎部特异表达的有GhCLE19-A-2；在叶片特异表达的有GhTDIF-D；在雄蕊中特异表达的有GhCLE9-D (图4-A)。

为了确定GhCLE基因家族中可能参与棉花根系抗旱的候选基因，对GhCLE14-A-2、GhCLE13-D-2及GhCLE25-D-1在不同水分处理的样本根系中的表达量进行比较发现，GhCLE14-A-2和GhCLE25-D-1在干旱处理后的样本根系中下调表达，只有GhCLE13-D-2在干旱处理后的样本根系中上调表达，说明该基因受干旱胁迫诱导后上调表达，这与拟南芥AtCLE25的表达模式相同[15]，可能参与了棉花根系抗旱过程(图4-B)。因此，本研究选取GhCLE13-D-2基因进行后续功能分析，研究其在棉花应对干旱胁迫的响应中的生物学功能。

图4 GhCLE表达模式分析

A：GhCLE基因家族成员在棉花各个组织的表达量热图。B：根系特异表达基因GhCLE13-D-2、GhCLE14-A-2和GhCLE25-A-1在干旱处理和CK处理下的表达量(FPKM值)。*、**、***分别表示在0.05、0.01、0.001概率水平差异显著。

2.5 GhCLE13-D-2基因VIGS功能验证

本研究利用VIGS技术特异性沉默了陆地棉(Jin 668)中GhCLE13-D-2基因，由于该基因在棉花基因组中存在2个同源基因，容易造成“脱靶”效应。因此，为了避免出现“脱靶”效应，本研究对3个GhCLE13基因的CDS序列进行了比对，选取了GhCLE13-D-2与另2个GhCLE13基因的差异CDS序列进行了引物的设计。注射TRV::GhCLA的阳性对照株系2周后出现白化表型(图5-A)，表明TRV有效地沉默目的基因。利用RT-qPCR检测TRV::GhCLE13-D株系的沉默效率，发现VIGS沉默株系的GhCLE13-D-2基因表达水平相比对照显著降低(图5-B)，表明TRV能有效沉默GhCLE13-D-2基因。

干旱处理7 d和10 d分别观察植株叶片受旱表型发现，CK处理组中2种株系叶片表型均无明显差异(图5-C)；干旱处理组中，基因沉默株系在第7天首先出现轻微叶片萎蔫、卷曲，而对照株系未在第7天出现叶片萎蔫(图5-D)；干旱处理第10天，TRV::GhCLE13-D-2株系叶片萎蔫程度显著高于TRV::00植株(图5-E)。

通过不同株系MDA含量的测定发现，在正常处理下，基因沉默株系和对照株系的叶片MDA含量无明显差异；而在2周干旱处理过后，基因沉默株系叶片的MDA含量显著高于对照株系(图5-F)，表明目的基因的沉默严重影响了植株的抗旱性，造成了MDA在叶片中积累量增加，证明了GhCLE13-D-2基因具有提高棉花抗旱性的功能。

图5 VIGS试验验证GhCLE13抗旱功能

A：正常处理下对照组和VIGS沉默株系；B：干旱处理7 d后对照组和VIGS沉默株系叶片表型；C：干旱处理10 d后对照组和VIGS沉默株系叶片表型；D：TRV::GhCLA株系白化表型；E：VIGS沉默株系和对照株系中GhCLE13-D-2基因的相对表达量；F：正常处理和干旱10 d后VIGS沉默株系和对照组MDA含量(nmol g^-1)。标尺为3 cm。*、**、***分别表示在0.05、0.01、0.001概率水平差异显著。

3 讨论

棉花是一种比较耐旱的经济作物[34]。但近年来，全球气候的改变导致干旱的加剧，加之我国棉花主产区新疆淡水资源的匮乏[35]，严重影响了我国棉花的总产量、质量以及产业发展[36-37]。因此，挖掘更多抗旱功能基因、培育抗旱性更加优良的棉花新材料和品种的需求迫在眉睫[38-39]。在以往的研究报道中通过基因工程克隆的抗旱基因，并通过转基因技术提高了棉花的抗旱性[40]。但目前关于小肽基因参与棉花抗干旱方面的研究少见报道。

小肽是由植物体内合成的，对植物生长发育有着重要作用的多肽激素，具有氨基酸序列长度较短，在植物体内含量极低等特点。植物小肽的种类众多，如在番茄中参与病虫害防御的系统素(Systemin，Sys)[3]、调控植物细胞增殖的PSY1[4]、调控烟草细胞有丝分裂的RALF小肽[40]、调控植物分生组织发育的CLV3 (CLAVATA3)及所在的CLE基因家族等。

CLE小肽家族在植物中广泛存在，可以参与植物的抗逆境胁迫过程，是目前植物界最大并且研究最多的小肽家族。目前在拟南芥[22]、水稻[41]、杨树[42]和玉米[13]等物种中都鉴定出了CLE基因，并且开展了深入的研究[43]，CLV3小肽是CLE基因家族中的明星基因，它与CLV1/CLV2和WUS共同形成反馈调节环维持拟南芥RAM和SAM细胞的增殖分化[10]。同时，CLE基因还参与了植物抗干旱胁迫的信号转导，如拟南芥的CLE25基因的表达受到干旱胁迫诱导，并通过间接调控ABA的合成来控制气孔的关闭，减少水分的蒸腾，协助植物应对干旱的胁迫[16]。目前，在棉花中也有CLE基因家族鉴定的相关研究报道，不过由于使用的基因组版本的差异，不同研究的鉴定结果也有所差异，主要差异体现在CLE基因的个数略有不同[19-20]，因此本研究以陆地棉为研究对象，首先通过生物信息学方法，在全基因组层面重新鉴定出了40个CLE基因，这与之前几篇研究中的CLE基因数量均略有差异，这可能是由于我们使用了更高质量的基因组[21]以及更严格的阈值和筛选条件。陆地棉CLE基因家族中多数基因不包含内含子，这符合了CLE基因结构较为简单的特点[14,16]。保守结构域分析发现GhCLE基因多肽的N-端包含一段基序为LLJLJLLLLLSJQASRRNVLI的信号肽，C-端包含一段基序为RRVPTGPBPLHN的CLE motif；其他区域为可变区域，氨基酸序列保守性较差。此外，其中一个CLE家族成员Ghir_D11G033760的C-端包含了8个CLE motif。蛋白质理化性质分析表明，除Ghir_D11G033760以外，其他成员氨基酸序列长度在74~131 aa，符合小肽的序列长度特点。所有CLE蛋白的平均等电点大于7，说明陆地棉CLE多肽激素大体呈碱性，所有理化性质均与其他研究的观点一致[19-20]。以每个CLE基因的上游2000 bp作为启动子区域，进行了顺式作用元件分析，结果显示，CLE基因的启动子区域包含了光响应元件、激素响应元件、植物生长发育调控元件以及胁迫响应元件，说明了GhCLE小肽可能在光的诱导下与多种植物激素相互作用，共同参与棉花的生长发育以及胁迫响应过程。通过对NCBI数据库棉花各个组织转录组数据进行分析，在转录组层面解析了CLE基因在陆地棉不同组织的表达情况，CLE基因在棉花各个组织都有表达，但表达量过低，符合小肽激素微量高效的特点，这与其他研究的结论一致。通过对本课题组前期测得的棉花根系转录组数据进行分析，筛选出1个具有推动棉花根系抗旱潜力的CLE基因GhCLE13-D-2，该基因在棉花受到干旱处理后在根系中呈现上调表达，这与拟南芥CLE25表达趋势一致[14]。为了验证这个猜想，我们对该基因进行克隆并构建了VIGS基因沉默载体，得到了TRV::GhCLE13-D-2基因沉默和TRV::00对照株系，基因沉默后植株的基因表达、表型和生理生化指标等进行了分析：在干旱处理下，沉默植株与对照组相比均表现出更敏旱的叶片萎蔫表型；丙二醛(MDA)是植物受到胁迫后积累的有害物质，通过MDA含量测定可以间接表征植物的抗逆性[32]，我们对不同株系的棉花叶片进行了MDA含量的测定，试验结果显示在沉默GhCLE13-D-2后，叶片MDA积累显著增加。以上试验结果证明了沉默GhCLE13-D-2基因有效地降低了棉花地抗旱性，表明GhCLE13-D-2基因可能参与了棉花根系抗旱过程。但本研究只对该基因的功能进行了初步的验证，其具体的作用机制仍有待进一步研究。

4 结论

CLE小肽家族参与了棉花的抗旱过程，本研究利用生物信息学方法在陆地棉全基因组鉴定到40个GhCLE基因，通过对GhCLE基因的DNA和氨基酸序列分析得出，大部分GhCLE基因不包含内含子，氨基酸序列长度在74~131 aa，并且都含有保守的CLE结构域和信号肽，属于碱性蛋白；GhCLE基因上游启动子区域包含光响应元件、激素响应元件、植物生长发育调控元件以及胁迫响应元件；利用RNA-seq数据构建GhCLE基因的表达量热图发现，GhCLE基因在陆地棉多个组织均有表达；VIGS试验结果表明，GhCLE13基因在棉花根系抗旱过程发挥了正向调控作用，但具体的作用机制仍待进一步研究。本研究对棉花抗旱基因挖掘和棉花中小肽组学的研究提供了重要的理论依据。

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本研究由兵团财政科技计划项目(2022DB012)和农业生物育种国家科技重大专项(2023ZD04038)资助。

^* 通信作者: 袁道军, E-mail: robert@mail.hzau.edu.cn

^** 同等贡献。戎宇轩，E-mail: rong19990831@webmail.hzau.edu.cn；惠留洋，E-mail: hly111@webmail.hzau.edu.cn

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期刊简介

《作物学报》是中国科学技术协会主管、中国作物学会和中国农业科学院作物科学研究所共同主办、科学出版社出版的有关作物科学的学术期刊。前身可追溯到1919年创办的《中华农学会丛刊》。主要刊载农作物遗传育种、耕作栽培、生理生化、种质资源以及与作物生产有关的生物技术、生物数学等学科具基础理论或实践应用性的原始研究论文、专题评述和研究简报等。《作物学报》从2001年起连续22年被中国科技信息研究所授予“百种中国杰出学术期刊”称号。2013年和2015年被国家新闻出版广电总局评为“百强科技期刊”, 2011年和2018年获“中国出版政府奖期刊奖提名奖”。据北京大学图书馆编著的《中文核心期刊要目总览》登载, 《作物学报》被列在“农学、农作物类核心期刊表”的首位。2019-2023年获中国科技期刊卓越行动计划梯队项目资助。2020年入选农林领域中国高质量科技期刊分级目录T1类。

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