文献解读|单细胞RNA测序揭示血脂异常诱导的舒张功能障碍模型中心脏巨噬细胞代谢应激依赖性激活

背景：射血分数保留心衰（HFpEF)是指，在心室收缩功能正常或轻度减低的情况下，心室肌松弛性和顺应性减低使心室充盈减少和充盈压升高，从而导致肺循环和体循环淤血的一组临床综合征是一类异质性较大的综合征，有多种临床表型。代谢应激与HFpEF密切相关，但代谢变化如何影响心肌炎症尚不清楚。

结果：以高脂饮食喂养的ApoE基因敲除小鼠（ApoE KO-WD小鼠）重现了HFpEF的许多特征。从中分选CD45+细胞进行单细胞RNA测序，以评估舒张功能障碍中的炎症情况。心脏的主要免疫细胞类型包括巨噬细胞衍生的4个亚群，仅在ApoE KO-WD小鼠中确定了促炎特征群。脂质超载通过内质网应激途径介导，对巨噬细胞中炎症基因的激活有直接影响。对巨噬细胞至心肌细胞调节轴的研究揭示了巨噬细胞分泌的多种炎症细胞因子通过影响肥大、纤维化和自噬等途径对心肌细胞产生影响。最后，作者描述了钠葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）在此模型中的抗炎作用，有望成为HFpEF靶向治疗药物。

单细胞RNA测序

1. 单细胞测序技术表征HFpEF患者心脏免疫细胞亚群

以高脂饮食喂养的ApoE基因敲除小鼠重现了HFpEF的许多病理特征，如舒张功能障碍、运动耐受明显下降、冠脉血流储备下降并且有明显的肺充血等。为进一步剖析HFpEF模型中的炎症特征，作者分选CD45+细胞进行了单细胞RNA测序。无监督聚类鉴定出15个CD45+细胞簇，其中巨噬细胞占比最多，其次是T细胞。鉴于心脏巨噬细胞在促进舒张功能障碍中的已知作用，作者对巨噬细胞做了进一步细分，其中Timd4+细胞群占比最高，其次分别是MHCIIhigh细胞、CCR2+细胞和干扰素刺激细胞群，并通过FACS证实了这些细胞的存在。作者对各群细胞的marker基因做了IPA分析。已知具有抗炎特性的核受体信号通路在Timd4+亚群中富集；MHCIIhigh和CCR2+巨噬细胞的特征是促炎通路高度富集；干扰素信号通路与干扰素刺激的巨噬细胞独特相关。综上所述，作者的数据证实了小鼠心脏中存在常驻（促修复）和招募（促炎症）心脏巨噬细胞。

2. scRNA-seq数据集差异基因表达分析揭示代谢应激对巨噬细胞的影响

为了确定疾病进展过程中巨噬细胞的转录组变化，作者使用Monocle3构建了细胞发育轨迹，并将WT-CD背景设置为起点。结果显示，许多不同的转录状态向病理状态发展，这些转录状态与基因型、饮食方案以及两者的结合密切相关。伪时间轨迹的进展主要由饮食驱动，而单独基因型只起到边际效应。

为了进一步探讨基因型、饮食和这两个因素联合对巨噬细胞转录谱的影响，作者进行了差异分析。单独基因型或饮食组分别有285个、270个差异基因，而饮食和基因型的组合有467个差异基因，证实了两种情况的存在是心肌内巨噬细胞病理激活所必需的。单独饮食或基因型可激活许多代偿性适应性反应，包括：在HFpEF中不受调控的未折叠蛋白反应、可改善高脂饮食致肥效应的一氧化氮信号转导、NRF2介导的氧化应激反应、自噬途径等。相比之下，饮食和基因型的结合与炎症和应激相关的通路激活有关，表明与病理状况特异性相关的适应不良反应。

随后作者使用SCENIC算法识别上游转录因子（TF）。虽然基因型和饮食单独导致各自亚群中TF的激活，但两者的结合增加了更多TF的活性。其中有几个TF参与调节未折叠蛋白反应的3个分支：IRE1/XBP1，PERK/ATF4和ATF6。ATF6分支在ApoE KO-WD小鼠的巨噬细胞中被唯一激活，表明可能由于心肌饱和脂肪酸积累而出现进行性内质网（ER）应激反应。此外，炎症激酶NF-κB1和NF-κB2也与未折叠蛋白反应的激活密切相关，当基因型与饮食结合时，它们被特异性激活，这表明HFpEF背景下代谢应激与炎症信号通路之间存在密切关联。

3. HFpEF中代谢应激相关的炎症

作者猜测血脂异常与心脏代谢的特定改变有关，这反过来又会促进促炎环境。为此，在WD治疗7周后，对心脏632种代谢物进行检测。ApoE KO-WD组共有44%的代谢物被特异性调节，其中大部分来自脂质途径。虽然饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸水平在WT和ApoE KO小鼠中增加的程度相似，但WD与ApoE KO小鼠左心室多种不饱和脂肪酸的显著减少以及中链和长链酰基肉碱的增加有关。考虑到饱和脂肪酸和酰基肉碱具有促炎特性，而不饱和脂肪酸具有抗炎和心脏保护作用，观察到的心脏代谢变化可能是心脏促炎状态的基础。

为了测试这些饱和脂肪酸是否与巨噬细胞的促炎激活有关，作者从WT和ApoE KO小鼠中获得骨髓来源的巨噬细胞，并将它们单独暴露于月桂酸盐、肉豆蔻酸盐或两者的组合中。结果显示，与HFpEF相关的多种促炎介质的表达显著增加，且ApoE KO组中Tnf、Il6、Cxcl10和Cxcl2的诱导显著增加，表明巨噬细胞中ApoE信号传导对观察到的表型转换很重要。循环炎症蛋白已被证明与HFpEF患者的合并症负担和血流动力学恶化和右心室功能障碍的超声心动图指标呈正相关，支持HFpEF患者的合并症-炎症范式。综上所述，作者的数据揭示了代谢应激驱动的巨噬细胞激活的细胞基础，表明局部心脏环境的变化可以使巨噬细胞偏向炎症表型。

4. 细胞间通讯识别巨噬细胞到心肌细胞的调节轴

已知巨噬细胞和心肌细胞之间的直接串扰与多种病理情况下的心脏重塑有关，为了解析HFpEF模型中巨噬细胞与心肌细胞的信息交流，作者从小鼠心脏中分离心肌细胞并进行大量rna测序，应用NicheNet计算探索差异基因的一个子集是否是巨噬细胞和心肌细胞之间信号网络的一部分。在心肌细胞中发现的356个基因中，预计有57个是巨噬细胞分泌配体的靶标。在巨噬细胞-心肌细胞通讯轴的界面上发现的靶点在多种心脏应激途径中富集，如肥大、纤维化和自噬，以及WNT/β-catenin信号传导。此外，TGF-β和BMP6之间的相互作用可能是调节心脏重塑的另一个重要轴的基础。TGF-β-BMP信号通路促进细胞凋亡和纤维化，参与细胞外基质重塑，并与IL-15与氧化应激反应基因（如Fos、Sod和Mafk）的相互作用，也可能通过激活NRF2-氧化反应通路导致心功能障碍。总之在HFpEF中，活化的巨噬细胞可能通过激活几种与应激相关的途径直接促进心肌细胞功能障碍。

5. 达格列净可缓解代谢应激相关HFpEF的心肌炎症

上述研究结果表明代谢应激诱导心脏免疫反应，作者推断靶向代谢将对心肌炎症和心功能有有益的影响。SGLT2i可以通过极化处于抗炎状态的巨噬细胞来减轻肥胖引起的白色脂肪组织和肝脏炎症，为检验SGLT2i是否能改善心脏免疫浸润情况，作者将被喂食WD7周并出现舒张功能障碍的ApoE KO小鼠随机分配给SGLT2i达格列清或载药8周，然后通过超声心动图进行评估。结果显示，在HFpEF条件下，达格列净改善了心肌肥厚的各项参数和舒张功能不全，肺充血减少，心脏驻留的抗炎Timd4+巨噬细胞的相对丰度完全恢复，促炎相关基因下调。ApoE KO小鼠心脏CCR2-巨噬细胞中，多种参与炎症激活和细胞应激反应的通路被下调。综上所述，本研究证实了SGLT2i的多效抗炎作用，并提出了一种新的可能性，即达格列净对心功能障碍的有益作用也可能通过其恢复Timd4+巨噬细胞的丰度和稳态功能而发生。

参考文献：

1. Panico C, Felicetta A, Kunderfranco P, et al (2024) Single-Cell RNA Sequencing Reveals Metabolic Stress-Dependent Activation of Cardiac Macrophages in a Model of Dyslipidemia-Induced Diastolic Dysfunction. Circulation 150:1517–1532. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.122.062984