CRISPR智库 | CORDSv2：一锅法RPA-Cas12a体系检测DNA/RNA病毒

一锅法RPA-Cas12a因其便捷和高灵敏度等优势，正迅速成为最受欢迎的POCT检测工具。尽管针对一些特定靶标的一锅法检测体系已有报道，但针对新靶标的高效一锅法检测体系开发，仍然存在很大的挑战。华南理工大学黄黎珍课题组建立了一种快速、通用的，基于合理平衡扩增过程和Cas12a反式切割过程的一锅RPA-Cas12a检测法CORDSv2，实现了对SARS-CoV-2、ASFV、HPV16、HPV18等多种靶标的超灵敏检测、可视化检测。该研究“A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses”发表在Biosensors and Bioelectronics期刊上。

报道的两步法CORDSv1，已成功应用于ASFV, SARS-CoV-2病毒及其变体的检测。CORDSv1-SARS的荧光检测灵敏度为10⁻¹⁷ M，试纸条检测的灵敏度为10⁻¹⁵ M。然而将RPA和Cas12a反应整合到一管时，检测灵敏度显著降低。为此，研究团队首先找出一锅反应中RPA和Cas12a反应的相互作用，然后进行相应的体系优化。

作者首先发现了12 nt随机序列的探针（5'-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3'）可能在一锅反应中并不稳定。随后作者将ssDNA探针添加到RPA等温扩增混合物体系中，37℃孵育30 min，随着RPA酶浓度的增加，荧光响应值升高，这表明ssDNA探针可能被RPA混合体系中固有的DNA聚合酶外切酶活性裂解。为了解决探针的非特异性裂解问题，作者根据Cas12a的反式裂解反应特征，调整了探针的长度和二级结构，设计了5 nt的探针FQ2和G-triplex探针FQ3进行对比实验。结果表明，RPA对探针FQ2的裂解明显少于其他探针，稳定性最好（图1 A）。且FQ2能进行更有效的CRISPR/Cas12a反式切割（图1 B）。因此，选择FQ2探针进行后续一锅法检测。

作者还发现了Cas12a可能通过过度消耗初始模板来抑制一锅反应中的RPA扩增。对此作者通过比较来自不同RPA试剂盒的三种缓冲液对Cas12a活性的影响来优化反应缓冲液。在AMP Future缓冲液中，Cas12a对RPA底物的活性最低且一锅反应荧光响应最高，更利于一锅法检测（图1 C-D）。随后，作者进一步对一锅反应中的组分浓度和反应温度进行了优化，以提高一锅法检测性能。结果表明最佳探针和Cas12a-crRNA复合物用量分别为800 nM和100 nM，最佳反应温度为37℃（图1 E-H）。

基于以上实验，作者推测通过提高RPA的初始扩增率，降低Cas12a的初始顺式活性，可以提高一锅法检测的灵敏度。因此，作者设计了两种针对SARS-CoV-2 N基因保守区域的crRNA，一种具有典型的原间隔子相邻基序（cPAM：TTTV），另一种具有次优的原间隔子相邻基序（sPAM）；同时设计了对应两组crRNA靶标的引物，引物组1在28841~29103位点扩增262 bp，引物组2在28870~28990位点扩增121 bp（NCBI RefSeq：NC_045512.2）（图2 A）。结果表明，引物组2比引物组1等温扩增更快、更高效（图2 B）。另一方面，Cas12a/sPAM在6 min处可以检测到反式切割活性，而Cas12a/cPAM在4 min处可以检测到反式切割活性（图2 C）。然后，作者通过将两个引物组与crRNA结合，创建了四种一锅分析方法。在cPAM和sPAM的一锅检测实验中，引物组2在40 min时的LOD分别为10⁻¹⁷和10⁻¹⁸ M，与两步法检测水平基本相同。相比之下，引物组1在反应40 min时，sPAM组灵敏度为10⁻¹⁶ M，cPAM组灵敏度为10⁻¹¹ M（图2 D-K）。综上，通过合理筛选高效RPA引物和慢速crRNA，建立了可靠的、高灵敏度的一锅CORDSv2-SARS检测法。同理，多个靶标（CORDSv2- ASFV，CORDSv2-HPV16/18）的一锅检测法也成功建立：CORDSv2-HPV16和18的LOD（60 min）分别为10⁻¹⁶和10⁻¹⁷ M。CORDSv2对上述所有靶标的检测灵敏度等同或优于传统的两步法检测水平。

图2. 次优PAM及不同引物组对CORDSv2的影响

采用引物组2和sPAM crRNA组合进行SARS-CoV-2一锅法检测。作者通过加入5 U M-MuLV逆转录酶和0.05 U RNase H，建立了RT-CORDSv2检测体系。以pUC57-N质粒为底物时，试纸条检测的LOD为10⁻¹⁵ M，低于荧光法10⁻¹⁸ M（图3 B-C）。作者随后使用RT-CORDSv2测量SARS-CoV-2病毒样本。将病毒RNA直接转移到RT-CORDSv2反应管中，37℃孵育40 min。18份小于35 Ct值的样品，荧光法和试纸条检测均显示RT-CORDSv2阳性，6份大于35 Ct值的样品，荧光法和试纸条检测均显示RT-CORDSv2阴性（灵敏度100%，特异性100%）（图3 D-F）。上述结果表明，在RT-CORDSv2中，在37℃时RT反应也能有效进行。

图3. RT-CORDSv2系统高灵敏检测SARS-CoV-2

图4. CORDSv2系统高灵敏度、高特异性检测ASFV

为了方便CORDSv2的POCT应用，作者设计了一种小型的便携式检测设备hippo-CORDS (Heating and Imaging Powerfully Portable device for One-pot Cas12a-based Onsite and Rapid Detection System)。该设备集成了加热模块和成像模块（图5 A）。加入样品后，将CORSv2的反应管转移到装置中，将温度提前设置为37℃。孵育40 min后，打开LED蓝光，肉眼观察荧光信号或使用智能手机拍照。

作者首先用不同量的质粒作为底物，测量了使用该装置的CORDSv2的灵敏度，结果显示LOD达到10⁻¹⁷ M，灵敏度比荧光检测低10倍（10⁻¹⁸ M），比试纸条（10⁻¹⁵ M）的检测灵敏度高100倍（图5 B，D）。使用该设备，CORDSv2-ASFV的LOD为10⁻¹⁷ M（图5 C,E）。然后对该设备的样品检测性能进行了验证。24份SARS-CoV-2病毒样本检测结果与荧光和试纸条检测结果一致（图5 F-G）。对于ASFV血清样本检测，对小于35 Ct值的样品检测灵敏度为97%（29/39），小于荧光法检测（100%，9/9），但高于试纸条检测（78%，7/9）（图5 H-I）。一步移液与低成本便携设备相结合，更有利于POCT检测。

此外，为了方便用户，作者将除目标物外的所有CORDSv2组分冻干到单个反应中。作者选择CORDSv2-ASFV进行冻干试验，并验证其性能。结果显示，冻干系统在4℃保存7天或室温保存5天后，对10⁻¹⁵ M的靶标可进行有效检测（图6 B-J）。

对于一锅法ASFV检测，输入188条ASFV基因组序列后，通过AutoCORDSv2在3h内可自动获得45种crRNA和相应的引物。前4位的crRNA及其引物在CORDSv2检测中证实有效。此外，作者还进一步使用AutoCORDSv2进行了HPV16检测的快速设计。输入777条HPV16的基因组序列，能在6 h内自动筛选出63种crRNA和相应的引物。筛选出的crRNA及其引物在CORDSv2检测中证实有效。因此，AutoCORDSv2可以作为一种可靠的自动化筛选工具，简单地筛选crRNA和crRNA引物。

[1] Lin C, Chen F, Huang D, Li W, He C, Tang Y, Li X, Liu C, Han L, Yang Y, Zhu Y, Chen R, Shi Y, Xia C, Yan Z, Du H, Huang L. A universal all-in-one RPA-Cas12a strategy with de novo autodesigner and its application in on-site ultrasensitive detection of DNA and RNA viruses. Biosens Bioelectron. 2023 Nov 1;239:115609. doi: 10.1016/j.bios.2023.115609. Epub 2023 Aug 18. PMID: 37611446.

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