文献解读 | 整合单细胞RNA测序和空间转录组学破译人类子宫腺肌症的全面转录图谱

子宫腺肌病是一种缺乏有效治疗的妇科疾病。关于“内陷”和“化生”理论的争论仍然存在。子宫内膜-子宫肌交界处（EMJ）连接子宫内膜和子宫肌层，对子宫腺肌症的诊断和分类具有重要意义，但其深入研究才刚刚开始。本项目利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组分析，绘制了异位子宫内膜、病变和EMJ的转录改变。在病变中，发现了独特的上皮（LGR5+）和侵袭性基质（PKIB+）亚群，以及WFDC1+祖细胞，支持“内陷”和“化生”发病理论之间复杂的相互作用。此外，还观察到内皮细胞的异质性和异常的血管生成信号，涉及血管内皮生长因子和血管生成素途径。异位子宫内膜和同位子宫内膜之间的细胞-细胞通讯明显不同，病变中的异常信号涉及多营养因子、TWEAK和WNT级联。这项研究揭示了独特的干细胞样细胞和侵袭性细胞亚群在腺肌病病变识别，功能失调的信号和EMJ异常；对于制定精确的诊断和治疗策略至关重要。

scRNA-seq；空间转录组

1. scRNA-seq研究子宫腺肌症细胞景观

为了研究子宫腺肌症细胞谱系的异质性，我们使用scRNA-seq分析了来自4名供体（3名子宫腺肌病患者和1名子宫肌瘤患者）的15份组织样本。根据术前磁共振成像和苏木精-伊红染色，从子宫各区域采集样本，包括子宫内膜（EnD）、子宫内膜-子宫内膜交界处（EnJ）、异位病变（EnC）和子宫内膜（EnM）（图1A）。空间转录组学与scRNA-seq相结合，阐明了细胞组织和信号通路（图1 B）。经过严格的质量控制和标准化，共获得54658个细胞转录组，平均有7731个独特转录本，每个细胞有2142个基因。基于已知标记的表达，用典型的细胞标记识别15种细胞类型，并通过UMAP进行可视化。图1D显示了子宫各区域细胞类型的分布及样本间的相关性（图1C-E）。

我们的分析显示，在子宫腺肌病和对照组中，不同子宫区域的细胞组成不同（图1F、1G）。正如预期的那样，上皮细胞和基质细胞主要定位于EnD、EnC和EnJ，而在EnM中没有发现（图1F）。腺肌病EnJ区的细胞类型主要为成纤维细胞、肥大细胞、平滑肌细胞和血管祖细胞（图1F）。与对照组相比，腺肌病样本显示EnJ中血管祖细胞和静脉内皮细胞（EC）富集（图1G）。在EnC中，除了基质细胞和上皮细胞外，我们还发现了多种细胞类型的富集，包括前列腺4的六跨膜上皮抗原（STEAP4+）血管周围细胞、动脉EC和静脉EC以及T细胞，这表明异常的血管和免疫细胞可能在子宫腺肌症的发展中起重要作用（图1G）。本研究发现子宫腺肌症子宫各区域的细胞组成不同，周围环境的变化如血管异常、免疫细胞增殖等是其发育的重要因素。

2. 腺肌病中上皮细胞和特征亚群的特异性基因表达

我们首先利用结合scRNA-seq数据的空间转录组学技术展示了子宫腺肌症的整体景观。在腺肌病变中，上皮细胞被基质细胞包围，与异位子宫内膜相比，异位病变表现出STEAP4+血管周围细胞（PV STEAP4）的富集，这表明血管生成微环境可能有助于子宫腺肌症的进展（图2A）。然后，将上皮细胞分为纤毛细胞亚组和非纤毛细胞亚组（图2B）。尽管它们在不同区域（EnC, EnJ, EnD）的分布是一致的（图2B），但它们的基因表达却存在显著差异（图2C）。在EnC上皮细胞中特异性表达的基因，如基质金属肽酶7 （MMP7）、血小板衍生生长因子亚基A （PDGFA）、KRT23（角蛋白23）、DMBT1（在恶性脑肿瘤中缺失1）和CLDN4 (claudin 4)，在迁移、血管生成和增殖相关的过程中表现出富集（图2C）。GO富集分析显示，基因富集于“调节肌动蛋白丝聚合”、“正向调节血管内皮细胞迁移”以及“肿瘤坏死因子（TNF）信号通路”和“MAPK信号通路”（图2D）。相反，在EnJ上皮细胞中特异性表达的基因表现出与细胞生长和细胞基质粘附相关的金属硫蛋白1E （MT1E）、金属硫蛋白1G （MT1G）和血红素加氧酶1 （HMOX1）的显著上调（图2C和2D）。这些数据表明，子宫内膜-子宫肌交界处的上皮细胞因基质重塑而发生改变，病变中的细胞表现出迁移和增殖特征。

值得注意的是，通过将scRNA-seq整合到空间转录组中，我们发现富含亮氨酸的含有G蛋白偶联受体5 （LGR5+）的细胞在EnC上皮细胞中显著富集（图2E）。为了验证LGR5的表达，我们对不同组织的上皮细胞进行了qRT-PCR。结果显示，EnC中LGR5 mRNA表达水平明显高于EnD（图2F）。此外，免疫荧光（IF）染色分析表明，LGR5在EnC上皮细胞中特异性表达（图2G、2H和S2A）。我们通过免疫组化（IHC）染色进一步验证，发现LGR5主要表达在子宫腺肌症EnC的上皮细胞中（图2I和2J）。LGR5是成体干细胞的标志物，据报道，表达LGR5的干细胞对子宫腺上皮的发育至关重要。基因LGR5也被认为是WNT信号通路的典型靶点。因此，我们假设LGR5+干细胞/祖上皮细胞作为异位病变的一个特征亚群，LGR5/WNT信号通路可能有助于子宫腺肌症（图2K）。SRY-box转录因子9 （SOX9）部分基因的表达，MSL1和MMP7与WNT信号通路相关的基因在EnC中显著上调（图2L）。总之，腺肌病的上皮细胞表现出独特的基因表达谱，LGR5+细胞在异位病变中显著存在，表明LGR5/WNT信号通路在疾病进展中起关键作用。

3. 子宫腺肌病的基质细胞和特征亚群

重新聚集了基质细胞，鉴定了5个基质细胞亚群和2个成纤维细胞亚群（图3A）。批量校正后，不同基质亚群分布在子宫的不同区域（图3B）。基质簇0和3主要位于EnD（图3B）。基质簇0的特征是表达APCDD1（大肠息肉腺瘤病下调1）、同源盒A11 （HOXA11）和补丁（果蝇）同源1 (PTCH1)，在“细胞分化”和“WNT信号通路”方面富集，而基质簇3富集泛素样蛋白（Ubl）偶联和蛋白折叠（图3C和3D）。值得注意的是，基质簇2是腺肌病变（EnC）特有的，其特征是表达与细胞生长、细胞迁移和脉管系统发育相关的ENPP2、PKIB、TM2B、ALCAM和FBXO32（图3C、3D、3F）。基质簇4的特征是表达WFDC1、EEF1B2、SFRP5，并富集典型的细胞质翻译（图3C、3D和S3A）。综上所述，我们的研究显示了子宫组织间质细胞的异质性。

由于基质簇2被认为是一个病变特异性亚群，我们首先通过qRT-PCR验证了基质簇2特异性表达的基因，包括ENPP2和PKIB。结果显示，与对照组和子宫腺肌症患者的EnD基质细胞相比，这两个基因在异位基质细胞中显著上调（图3E）。此外，空间转录组显示，PKIB+和ENPP2+基质细胞在异位病变中独特地分布在上皮细胞周围（图3G）。荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）染色证实了基质簇2的存在和组织学分布（图3H-J）。总之，我们的研究结果揭示了子宫腺肌病中病变特异性基质亚细胞类型，并发现PKIB，一种与细胞增殖和侵袭相关的基因，影响各种细胞过程，在该集群中显著增加。该研究确定了子宫腺肌症中5个间质和2个成纤维细胞亚群，其中一个病变特异性间质簇2表达增殖和侵袭相关的PKIB，可能与子宫腺肌症的发病机制有关。

4. 子宫腺肌症基质细胞与祖基质细胞的分化轨迹

为了深入了解基质分化，我们生成了基质亚群的RNA速率图，预测了三种发育轨迹（图4A）。基质簇4细胞位于拟时间轨迹的起始点，提示基质簇4是基质细胞的祖细胞。基质簇4指向基质0，然后是基质3表示正常子宫内膜路径（EnD路径），基质簇4指向基质2表示异位病变路径（EnC路径），基质簇4指向基质1表示子宫内膜-子宫内膜交界处路径（EnJ路径）（图4C）。值得注意的是，3例子宫腺肌症患者的轨迹方向完全一致（图4B）。接下来，我们绘制了细胞亚群之间和沿拟时间轨迹的差异表达基因图谱（图4D）。在祖基质细胞中检测到SFRP5的显著上调，主要定位于基质簇4（图4D和4E）。鉴于其作为WNT信号通路抑制因子的作用，该基因编码一种蛋白激素，可能潜在地调节子宫腺肌症发病机制。在EnD通路中，WNT信号通路相关基因（如APCDD1、VWC2、WNT5A、WNT4和子宫发育基因（包括HOXA10、HOXA11、FOXL2）上调。EnC通路中，ENPP2、PKIB、WNT16和NELL2的表达量为细胞级增加（图4D和4E）。为了验证路径中的基因，我们通过qRT-PCR进一步验证了WNT16、APCDD1、VWC2的表达水平（图4F）。为了进一步确定基质簇4的特征基因，我们发现WFDC1是最顶端的标记基因，它与炎症、修复和细胞迁移相关，主要在基质簇4中表达（图3C和4G）。通过空间转录组分析，WFDC1+细胞主要富集腺肌病的EnD、EnJ和EnC（图4H）。因此，我们通过FISH和IHC染色进一步验证，发现WFDC1主要表达在子宫腺肌症的EnC和EnJ区（图4I-K）。综上所述，间质祖细胞在子宫腺肌病中向病变细胞或正常子宫内膜分化的过程具有不同的轨迹，说明WFDC1+间质祖细胞可能作为病变特异性间质簇的前体细胞，在子宫腺肌病的发生发展中发挥重要作用。

5. 内皮细胞多样性和血管生成

内皮细胞（EC）在EnC中明显增加，这表明在腺肌病变中发生了血管生成（图1G）。我们确定了7个EC亚群，它们在腺肌病组织中分布不同（图5A、5B）。如EC -毛细血管簇主要分布在EnC、EnJ和EnM，对照组和子宫腺肌症组相似。此外，基因表达分析显示，不同腺肌病区免疫相关基因和血管生成相关基因表达上调差异（图5C和5E）。在EnJ中，与趋化因子相关的基因（CCL23、CCL21和免疫反应（TNFSF9、CTSC）的表达增加（图5D）。在EnD中，血管生成相关基因，如ARHGDIB 和GNAS主要上调（图5E）。通过空间转录组观察，在病变周围分布的质膜囊泡相关蛋白阳性（PLVAP+）细胞可以影响EC的通透性并调节血管通透性。此外，我们的研究还揭示了不同细胞类型中不同的血管内皮生长因子（VEGF）和ANGPT信号模式，表明复杂的血管生成环境（图5F）。血管生成信号和新生血管在内皮细胞亚群中发生改变。EC-tip响应血管生成信号，迁移和增殖形成新的血管结构，并分化为毛细血管内皮、动脉内皮和静脉内皮亚型。免疫球蛋白样结构域1和EGF样结构域1的ANGPT和TIE1、FLT1、VEGFR1和VEGFR2在EC-tip细胞EnC中的上调表明血管生成活跃（图5G）。此外，Notch信号的激活表明EC-尖端细胞成熟（图5G）。此外，ANGPT- tie轴被认为对血管生成至关重要，并且在子宫腺肌症的EnC中观察到ANGPTL、 ANGPT和VEGF信号的广泛细胞间通讯（图5H）。在EnC中，ANGPTL信号从nCili上皮细胞、肌球蛋白重链11 （MYH11+）血管周围细胞和成纤维细胞释放，并靶向内皮细胞、基质细胞和STEAP4+血管周围细胞。总体而言，在腺肌病区发现内皮细胞异质性和血管生成相关的差异信号。异常的血管通透性和血管生成可能导致大量月经出血等症状。

6. 子宫腺肌症细胞连接异常

最后，我们使用CellPhoneDB和CellChat分析了腺肌瘤异位和异位子宫内膜组织中细胞间的相互作用。在EnC中，基质细胞、成纤维细胞和EC之间的相互作用减少，而平滑肌细胞（SMCs）与其他细胞类型的相互作用增加（图6A和6B）。腺肌病的EnD和EnC中富集了不同的细胞通讯信号通路模式（图6C和6D）。在EnC中，PTN和肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导剂（TWEAK）是主要的输出信号，主要由成纤维细胞和MYH11+血管周围细胞分泌（6E和6F)。这些信号通路与细胞增殖、血管生成和免疫反应有关，并促进异位病变的进展。相比之下，EnD在SPP1和HH途径中富集，与子宫内膜接受性和基质细胞活性相关（图6H）。

EnC和EnD在关键信号通路如WNTs、胰岛素样生长因子（IGFs）和TNF中差异表达（图6G）。EnD中由增殖标志物Ki-67 （MKI67+）细胞、成纤维细胞和基质分泌的WNTs和IGFs在EnC中减少。免疫细胞，特别是巨噬细胞和T细胞的通讯也发生了变化，诱导TNF、CSF、LIFR和IL2信号通路。综上所述，我们的发现显示了腺肌病组织中通信模式的改变。观察到信号通路的变化，包括与细胞增殖、血管生成和免疫反应相关的信号通路。这表明子宫腺肌症的微环境发生了动态变化，导致了其复杂的病理生理。

子宫腺肌病是一种尚未完全了解的妇科疾病。为了解决这些空白，在本研究中，我们对覆盖整个子宫所有重要区域的子宫腺肌病和对照样本进行了单细胞RNA测序和空间转录组学分析。这使我们能够全面表征子宫腺肌症的细胞异质性，并阐明区域分子异质性，特别是在关键的子宫内膜-子宫内膜交界处。我们确定了腺肌病病变特有的独特上皮和基质亚群，揭示了复杂的血管生成微环境，并描绘了改变的细胞间通讯。离散细胞群、异常信号程序和区域差异的识别促进了我们对子宫腺肌症发病机制中复杂分子景观的理解。

我们的研究为子宫腺肌病的病理提供了开创性的见解。首先，我们建立了一个高分辨率的单细胞图，首次阐明了连接区的异质性。其次，本研究通过单细胞分析确定了腺肌病病变特异性的独特上皮（LGR5+）和基质（PKIB+）亚群。LGR5已被报道为成体干细胞的标记物，并鉴定出WFDC1+基质祖细胞群，可能作为病变特异性基质细胞的前体。我们提供了化生和内陷理论之间相互作用的见解。第三，确定的人群为精确诊断和治疗提供了目标。靶向侵袭性PKIB+基质细胞或祖细胞LGR5+上皮细胞可能促进靶向治疗的发展。血管生成和免疫信号异常突出了新型抗血管生成和免疫调节疗法的潜力。最终，这种集成的单细胞分析从根本上推进并重塑了对子宫腺肌症的理解。综上所述，本研究阐明了子宫腺肌症复杂的单细胞组合空间转录格局。该研究为化生和内陷理论之间的相互作用提供了见解。

参考文献：

Chen T, Xu Y, Xu X, Wang J, Qiu Z, Yu Y, Jiang X, Shao W, Bai D, Wang M, Mei S, Cheng T, Wu L, Gao S, Che X. Comprehensive transcriptional atlas of human adenomyosis deciphered by the integration of single-cell RNA-sequencing and spatial transcriptomics. Protein Cell. 2024 Jul 1;15(7):530-546. doi: 10.1093/procel/pwae012. PMID: 38486356; PMCID: PMC11214835.