期刊：Advanced Science
影响因子：14.3
伯豪技术服务产品：snRNA‐seq、伯优®细胞核分离试剂盒
导语
限制和重复行为 （RRB） 是自闭症谱系障碍 （ASD） 的主要症状，对个人健康构成重大风险。然而，RRB 产生背后的特定细胞和神经回路机制仍不清楚。在这项研究中作者发现背纹状体中表达多巴胺受体 D2 的中棘神经元 （D2-MSN） 中缺乏 ASD 相关蛋白 Neuroligin 1 （NLGN1） 与自我梳理和挖掘行为的持续时间和频率有关。Nlgn1 缺陷的 D2-MSN 过度激活，这与过度的自我梳理和挖掘行为有关。抑制 D2-MSN 的活性可减少这些 RRB 的持续时间和频率。此外，研究表明，自我梳理和挖掘行为的产生取决于 D2-MSN 活动的不同模式。该研究通过单细胞核 RNA 测序 （sn-RNAseq） 和蛋白质检测验证，发现 Nlgn1 缺陷小鼠中蛋白激酶 C （PKC） 的过度激活导致过度重复行为和神经元兴奋性增加，提出了产生自我梳理和挖掘行为的潜在机制，并给出了 ASD 的可能治疗方法和干预措施。
主要技术
snRNA‐seq，免疫组化，全细胞膜片钳、
伯优®细胞核分离试剂盒
（技术服务产品由伯豪生物提供）
研究结果
1. 在纹状体D2-MSN中抑制Nlgn1促进RRBs
过度的 RRB 在自闭症谱系障碍 （ASD） 患者和动物模型中都很常见。我们之前的研究表明，Nlgn1 KO 和 Het 小鼠都表现出显着的自我梳理行为（图 1A-C）。然而，所涉及的特定大脑区域和细胞机制仍不清楚。此外，我们发现 Nlgn1 缺陷小鼠在被引入床铺笼时表现出过度的挖掘行为（图 1E-H）。我们的结果表明，自我梳理和挖掘的频率显着增加，而每次会话的持续时间保持正常（图 1B-D 和 F-H）。进一步分析发现，这些变化在雄性和雌性Nlgn1缺陷小鼠(图S1A - D ,支持信息)中都得到了一致的观察。这些发现表明，Nlgn1缺失增加了重复行为发生的可能性，导致RRB总时间总体增加。
2. 背侧纹状体D2-Msn中的Nlgn1是正常重复行为的充分必要条件
纹状体在解剖学上分为背侧部和腹侧部，又称新纹状体和伏隔核，两者在神经环路和功能上存在差异。为了确定NLGN1调控重复行为的具体脑区，我们分别抑制了背侧和腹侧纹状体D2 - MSNs中NLGN1的表达。结果表明，抑制背侧D2 - MSNs中NLGN1的表达，增加了两种RRBs (图2A - J)的总时间和频率，而对腹侧D2 - MSNs中NLGN1的表达没有影响。为了进一步证实NLGN1通过背侧纹状体D2 - MSNs调控重复行为，我们将rAAV - D2 - CRE - mCherry病毒双侧注射到Nlgn1f / f小鼠的背侧纹状体，并允许5周在背侧纹状体(图2K , L)的D2 - MSNs中删除NLGN1的表达。如图2M - P所示，表现出自我修饰和挖掘时间的显著增加，我们在Drd2 - Cre小鼠( 图2Q - U )的特异性D2 - MSNs中敲低NLGN1也得到了类似的结果。相反，在Drd1 - Cre小鼠的特定D1 - MSNs中抑制NLGN1的表达并没有导致这两种rep的任何变化，为了证实过量的RRBs归因于D2 - MSN中NLGN1的缺失，我们通过将含有D2 - Cre ( rAAV-D2-CREmCherry)和Cre依赖的HA标记的NLGN1 ( rAAV-EF1αDIO-HA-NLGN1)的AAV病毒共同注射到成年Nlgn1 KO大脑中，将Nlgn1互补DNA ( cDNA )重新引入到背侧D2 - MSN中(图2V )。一周后，我们进行了行为学和蛋白检测。如图2W - Z所示，Nlgn1的重新引入有效地减少了KO小鼠的自我梳理和挖掘行为，表明背侧纹状体D2 - MSN中的NLGN1对于正常的重复行为是必不可少的。
3. 在Nlgn1缺失的小鼠中，D2 - Msn的兴奋性增加
为了探究NLGN1调控RRBs的细胞机制，我们首先用D2驱动的Cre和Cre依赖的m Cherry病毒( rAAV - D2 - CRE和rAAV - DIOmCherry ,图3A)标记D2 - MSN。然后，我们使用全细胞膜片钳记录评估了Nlgn1 KO和WT小鼠背侧纹状体中D2MSNs的兴奋性。结果表明，Nlgn1缺失后，(图3B )的静息膜电位( RMP )没有显著变化。然而，与WT小鼠相比，Nlgn1 KO小鼠的D2 - MSN兴奋性显著升高。(图3C , D)。我们在Nlgn1 KD小鼠(图3E - H)的D2 - MSNs中进一步证实了这些发现。为了研究D2 - MSNs在Nlgn1缺失的活体动物中是否也是超兴奋的，我们进行了在体纤维光度学记录，以测量WT和Nlgn1 KO小鼠背侧纹状体中D2 - MSNs的Ca2 +信号(图3I )。如图3J - L所示，与WT小鼠相比，Nlgn1 KO D2 - MSNs中Ca2 +事件的频率较高，而振幅保持不变。这些结果证实Nlgn1 KO小鼠D2 - MSNs的兴奋性在体外和体内均增加。此外，我们还发现WT和Nlgn1 KO小鼠的D2 - MSN钙事件特征没有显著差异。
4. 激发D2 - MSN对RRBs有促进作用
为了确定D2 - MSNs的异常激活是否对Nlgn1 KO小鼠中过多的RRBs是必需的。我们利用设计药物特异性激活的设计受体( DREADD )系统来抑制D2 - MSN的活性。我们将表达D2 - Cre和floxed工程化M4 -毒蕈碱受体( rAAV-EF1α-DIO-hM4D ( Gi) - mCherry的AAV病毒双侧注射到WT和Nlgn1 KO小鼠(图4A)的背侧纹状体。为了激活hM4D ( Gi )，在行为学测试前20分钟给予氯氮平- N -氧化物( CNO , 1mg · kg-1 ,腹腔注射)。在Nlgn1 KO小鼠中激活hM4D ( Gi )，显著降低了(图4B - E )的自我梳理和挖掘行为的持续时间和频率，而在WT小鼠中则没有。总的来说，我们发现在Nlgn1 KO小鼠中抑制D2 - MSN的活性可以减少两种RRB的持续时间。在WT小鼠中激活D2 - MSN可刺激RRB的生成；但是，自我梳理和挖掘所需要的激活模式是不同的。
5. D2 - MSN中的Nlgn1通过过表达的PKC活性调控兴奋过度和RRBs
为了研究 NLGN1 调节 RRBs 和 D2-MSN 高激发的分子机制，我们分离了 WT 和 Nlgn1 KO 小鼠的背侧纹状体组织，并进行了单核 RNA 测序 （snRNA-seq，图 7A）。为了可视化和识别具有不同转录特征的细胞群，我们对总共 21 788 个细胞（11,947 个来自 WT 和 9,841 个来自 Nlgn1 KO）进行了非线性降维（t 分布随机邻域嵌入 （t-SNE））来自合并组织 （n = 3）（图 7B）。然后做人工注释（图 7C），其中一个表现出 Drd2、Reln 和 Adora2a 高表达的簇，我们将其命名为 D2-MSN。随后，我们测量了 WT 和 Nlgn1 KO D2-MSN 之间的差异表达基因 （DEGs），并在 Nlgn1 KO 组中鉴定了 56 个下调基因和 21 个上调基因，DEGs 的GO分析强调了与神经元活动相关的几个生物过程，包括磷脂酰肌醇介导的信号转导和小 GTP 酶介导的信号转导（图 7E因此，我们假设参与磷脂酰肌醇代谢和小 GTP 酶途径的特定蛋白激酶的活性可能被改变。33-35] 这种改变可能会进一步影响 Nlgn1 缺陷型 D2MSN 的细胞活性，并导致过量 RRB 的产生。随后，我们测量了 Nlgn1 KO 和 WT 纹状体组织中蛋白激酶 C （PKC） 、蛋白激酶 A （PKA） 、蛋白激酶 B （Akt） 、p38 丝裂原活化蛋白激酶 （p38-MAPK） 和细胞外信号调节激酶 （ERK） 的磷酸化水平。结果表明，PKC 、 PKA 和 ERK 的活性显着增加，而 Akt 和 p38-MAPK 的水平在 Nlgn1 缺失后保持不变 （图 7F，G）。
总结
本研究发现背侧纹状体D2-MSN是Nlgn1调控重复刻板行为的关键脑区及关键细胞。通过单核RNA测序（snRNA-seq）和蛋白分析，进一步证明了D2-MSN中过度的神经兴奋和RRBs的发生与蛋白激酶C （PKC）的过度激活有关。在WT小鼠的背侧纹状体D2-MSN中，由于ASD相关蛋白NLGN1的表达，抑制了PKC活性并调节神经元兴奋性；在Nlgn1 敲除小鼠中，NLGN1的缺失引起D2-MSNs中的PKC活性异常增加，从而增强神经元的兴奋性并导致重复刻板行为。该研究为揭示自闭症核心表型——刻板行为发病机制提供参考价值，为自闭症的治疗起到实质性的推进作用。
参考文献：
Lv D, Liu A, Yi Z, Mu M, Wu M, Li X, Cao K, Liu R, Jia Z, Han J, Xie W. Neuroligin 1 Regulates Autistic-Like Repetitive Behavior through Modulating the Activity of Striatal D2 Receptor-Expressing Medium Spiny Neurons. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec 11:e2410728. doi: 10.1002/advs.202410728. Epub ahead of print. PMID: 39661696.
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