柠檬树是一种重要的柑橘类作物，预计2021年全球产量将达到2080万吨（粮农组织粮农组织统计数据库，2023年）。柠檬的主要加工过程是果汁生产，产生20%−30%的柠檬汁和50%−60%的废物，如：柠檬叶和果皮。
柠檬皮
一、柠檬皮跟水产养殖的关系
处理大量柠檬皮会对环境造成负担，而且处理这些废物的成本很高。柠檬皮废弃物的再利用符合实现农业循环经济的目标，也符合联合国可持续发展目标（SDG）。植物中的生物成分已被广泛研究以维持水生动物的健康状态。柠檬皮中的主要植物化学物质，如：柠檬酸、抗坏血酸、纤维、矿物质、类黄酮、类胡萝卜素、柠檬苦素和精油可以给鱼虾的健康带来许多有益的作用。
但值得注意的是，这些鱼在喂食高补充水平的干柠檬皮后，生长性能会下降。柠檬皮含有约15%的粗纤维，经检测可能会导致鱼类生长不良。哈萨纳等人 (2018)的研究称，经过益生菌发酵后，柠檬皮粉的纤维含量可以从21.5%降低到8%以下。此外，益生菌发酵草药或草药成分与益生菌的组合已被证明可以提高鱼类的免疫力并调节肠道微生物群，但在对虾养殖中应用的研究有限。
最近，屏东科技大学最近进行了一项研究，评估含有发酵柠檬皮的饲料，对虾肝胰腺形态、抗病性、生长性能和非特异性免疫指标的影响。
二、研究设计
1、实验室制备发酵柠檬皮（FLP），经测试化学成分为：水分7.66%；粗蛋白7.31%；脂质1.39%；和粗纤维分别为13.55%。
2、饲料设计为异氮和异脂的形式，以满足白对虾的营养需求。饲料中添加发酵柠檬皮（FLP）分别为：0%、1%、2%和3%四个水平的FLP。之前的研究表明，5%的添加水平会导致鱼类免疫反应和生长不良，因此本研究使用了最高水平的3%。分析了大致的成分，包括水分、粗蛋白、醚提取物（脂质）和灰分（表1）。
表1：饲料配方和大致成分 (%)。
3、无病原体PL15白虾虾苗由Apex水产养殖有限公司提供，虾苗在3500L塑料 (FRP) 水箱中适应实验室条件一个月，并喂食商业虾饲料（Grobest Group Limited）。
4、所有虾分为为四个组（每组饲料投喂4个水箱）。每个水箱都是循环系统的一部分，配备海绵、生物过滤器、紫外线灯和温度控制装置 (29±1°C)、溶解氧 (≥6mg/L)、盐度28–30 g/L。每周监测水中的氨和亚硝酸盐浓度，值分别<0.02mg/L和0.05-0.12mg/L。每天在08:00、12:00、16:00和20:00向虾喂实验饲料4次。喂食量设定为体重的6%，接近表观饱腹感。整个实验定为56天。
5、与第一次试验同时进行了第二次喂养试验，以检测溶藻弧菌感染。虾的体重和饲养方式与第一次饲养试验相似。虾被喂食四种实验饲料，喂养期也持续56天。
三、研究结论：
1、所有组虾的最终体重、增重率、饲料转化率、蛋白质利用率和成活率均无明显差异（p>0.05）（表2）。本研究强调，虾的生长性能不受含有高达3%的发酵柠檬皮饲料的影响。这表明用乳酸杆菌发酵的柠檬皮可以用作饲料添加剂，在饲料中添加量高达3%时不会对生长性能产生任何负面影响。这表明发酵柠檬皮（FLP）适合进一步研究其对虾的有益功能。
表2：饲喂含有不同发酵柠檬皮的饲料56天后对虾的生长性能结果。
2、饲喂1% FLP饲料的虾的总体水分含量高于饲喂2% FLP饲料的虾（表3）。添加2%和3% FLP的虾饲料显示出比添加1% FLP的虾饲料更高的灰分含量。与饲喂1%和3%FLP饲料的虾相比，对照组的全身粗蛋白含量较高。结果表明，全身的粗蛋白、水分和灰分含量具有相似的数值：例如：水分含量为74.47%−76.88%，灰分含量为2.31%−3.17%，粗蛋白含量为18.21%− 19.18%。因此，这表明饲料中添加FLP可能不会影响虾的身体成分。
表3：饲喂不同比例发酵柠檬皮饲料56天的白对虾全身粗蛋白、总脂、水分和灰分含量。
3、与对照组相比，饲喂1%和2% FLP的虾的总血细胞计数 (THC) 较高，而饲喂2% FLP的虾的酚氧化酶 (PO) 活性较高（图1）。作为相对原始的动物，循环系统中的血细胞在甲壳类动物的非特异性免疫反应中发挥着核心作用。在感染早期，入侵的病原体可以破坏圆形血细胞并导致严重的溶血损失。新生虾血细胞可以进行包括PO系统、吞噬作用、包装和凝固在内的免疫反应，以防止进一步的损伤 (Kuo et al., 2020)。
PO系统是一种非自我识别系统，是甲壳类动物预防病原体入侵的最重要的免疫机制之一。血细胞计数和PO活性常用于评估白虾的免疫力（Liu et al., 2004；Chang et al., 2013；Lin and Mui, 2017）。结果表明，与对照组相比，饲喂含有FLP的饲料的虾的总血细胞计数和PO活性有所提高，这表明FLP具有改善血液参数的有益作用。
图1：饲喂不同比例的发酵柠檬皮56天的白对虾的总血细胞计数和酚氧化酶活性。
图2：对虾经溶藻弧菌攻击72小时后的存活率结果。
4、72小时后，所有注射盐水的虾（空）都存活了。注射溶藻弧菌后，与对照组相比，饲喂2%和3% FLP的虾的存活率较高（图2）。与饲喂0% FLP对照饲料的虾相比，用2%和3% FLP组的虾存活率更高。这清楚地表明虾非特异性免疫反应的增强对病原体具有高抵抗力。根据对溶藻弧菌的免疫反应和抗性，本研究得出结论：FLP是一种旨在提高疾病免疫力的功能性饲料添加剂，建议在白对虾饲料中添加2%。
5、虾肝胰腺的形态变化如图3所示。在所有饲料组中，所有肝胰腺样本均未表现出形态变化。肝胰腺病变可能与SBM中的抗营养因子有关，例如：大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白(Zhang et al., 2013)。因为当作者设计实验时，为了避免肝胰腺中这些不必要的形态变化，本研究中使用的主要蛋白质来源是大豆浓缩蛋白 (SPC)，而不是 SBM。SPC是通过化学和物理加工产生的，导致大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的蛋白质变性（Gy
an 等人，2019）。这可以解释为什么在喂食测试饲料的虾中没有观察到肝胰腺损伤的症状，因此无法评估发酵柠檬皮对健康的影响。
图3：用不同比例的发酵柠檬皮喂养56天的白对虾的肝胰腺切片。放大倍数×200。L：肝胰管管腔；R：恢复细胞；B：B细胞分泌细胞；F：纤维细胞。
四、研究结论
本研究强调，用乳酸杆菌发酵的柠檬皮具有作为白对虾功能性饲料添加剂的潜力。这一结果有助于回收利用农副产品以实现可持续发展目标。特殊是，饲料中FLP含量高达3%时并未对虾肝胰腺的生长和形态产生任何负面影响。但是我们建议在虾饲料中添加2%的FLP，以增强受控实验室环境中的非特异性免疫反应和对溶藻弧菌的抵抗力。
