【专题论坛】肠道微生态研究技术和研究策略

文献来源：中华炎性肠病杂志，2024年第8卷第5期

作者：罗菀蓉  高杨  张文婕  朱亦君

作者单位：中山大学附属第一医院精准医学研究院

通信作者：朱亦君

引用本文：罗菀蓉，高杨，张文婕，等. 肠道微生态研究技术和研究策略[J]. 中华炎性肠病杂志（中英文），2024，8（5）：329-334. DOI：10.3760/cma.j.cn101480⁃20240715⁃00081.

“所有疾病始于肠道”——这句来自希波克拉底的古训在医学长廊中回响至今，预言了肠道在人类健康中的核心作用。现代科学正逐步揭开这一古老智慧的现代面貌——肠道微生态，这个由数万亿微生物编织的复杂网络，已被证实在代谢性疾病、自身免疫疾病、心理健康乃至癌症等多种病理过程和疾病状态中扮演关键角色。肠道微生态研究的快速进步得益于创新技术的涌现、突破性发现以及新思想的启迪。正如分子生物学先驱Sydney Brenner教授指出“科学的进步依赖于新技术、新发现和新想法，并且大致是按这个顺序进行的”。培养方法的演变、分子测序技术的出现以及多组学方法的整合，已经彻底改变人们对肠道微生物组的理解。这些技术突破为新发现铺平了道路，进一步揭示肠道微生物的复杂性和多样性以及它们与宿主间错综复杂的相互作用。此外，这些发现催生新的思想和研究策略，例如肠脑轴的探索和基于个性化微生物组的疗法。

本文将探讨推动肠道微生态研究领域的关键技术和研究策略，回顾过往具有里程碑意义的重大发现，并对未来的发展方向与挑战进行展望。

肠道微生态是指由肠道内数以万亿计的微生物构成的复杂网络，是宿主健康的重要决定因素之一。这些微生物主要包括细菌、真菌、病毒和古菌等，在维持微生态平衡中发挥重要作用［1］。肠道微生态的失衡，也称为菌群失调，已被报道与多种疾病的发生发展有关，如炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）、肥胖、糖尿病、心血管疾病以及精神心理疾病等［2-3］。在疾病状态下，肠道微生物的构成显著改变并将影响治疗效果和疾病的结局。Franzosa 等［4］开展的一项 IBD 患者微生物群代谢活性变化的调查研究，对美国发现队列（PRISM）和荷兰验证队列（LifeLines DEEP 和 NLIBD）的 220 个粪便样本进行宏基因组分析，观察到IBD患者的微生物多样性普遍减少及活泼瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和梭形梭菌（Clostridium clostridioforme）等 有 害 菌 的 富 集 。Yilmaz等［5］从克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）患者的肠道活检中确定不同微生物分类群的关联网络，发现毛螺菌科（Lachnospiraceae）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）的紊乱与抗肿瘤坏死因子 α 生物制剂疗效较差和CD患者术后复发相关。因此，采用更为先进的研究技术和合理的研究策略，全面深入地探究肠道微生态，对维护宿主的健康至关重要。

肠道微生物种类繁多，功能复杂，且个体间存在显著差异。同时，肠道微生物与宿主的相互作用机制复杂多样，需要结合多学科的知识和方法进行研究。因此，肠道微生态的研究技术是多维度的，涵盖从传统微生物培养到现代分子生物学技术的广泛领域，见图1。

 微生物培养是肠道微生态研究的基石，通过优化培养条件，如气体组成、温度、pH 值、营养物质等，促进较低浓度的挑剔微生物的生长。例如，为了模拟肠道微生物的缺氧生存环境，厌氧罐、GasPak系统和厌氧室等系统相继问世［6］；部分微生物具有特定的营养需求，如补充黏蛋白（嗜黏蛋白阿克曼菌 Akkermansia muciniphila）和醋酸盐（普拉梭菌 Faecalibacterium prausnitzii）等［7⁃8］。此外，基于微流控高通量的分离培养方法的出现，弥补了传统平板涂布法耗时费力的不足［9⁃10］。Ma 等［11］将高通量测序方法与该技术相结合，鉴定出一个属于瘤胃球菌科的新菌属。刘双江教授团队发展了肠道微生物培养技术，构建健康人肠道菌群、模式动物小鼠和食蟹猴肠道菌群资源库［12⁃14］。Zou 等［15］使用11 种不同的培养基对 155 例健康志愿者的粪便进行厌氧培养，筛选出1 520株分离株，其中264株为新发现菌株。尽管有如此多的发现，但根据统一人类胃肠道基因组的最新研究，高达 70% 的统一人类胃肠道基因组物种尚未培养［16］。

 高通量测序技术已成为肠道微生物研究的核心技术，标志着肠道微生态研究进入一个新时代。该技术在肠道微生物研究中的应用，主要包括16S rRNA基因测序、宏基因组测序、宏转录组测序和宏病毒组测序等。

1.16S rRNA基因测序：16S rRNA基因测序是鉴定和定量肠道微生物群落成员的一种常用方法。16S rRNA 作为核糖体 RNA 的一个亚基，普遍存在于细菌和古菌中。其基因在细菌中的高保守性和可变区序列的物种特异性，是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”。通过高通量测序，研究者能够快速获得大量16S rRNA基因序列，从而揭示肠道微生物群落的组成［17］。

尽管16S rRNA基因测序通常能在属和种的水平上提供较高分辨率的分类学信息，但有时难以区分非常相似或同源的物种。且该测序技术主要针对细菌，对于其他类型的微生物如真菌、病毒和古菌，需要使用其他标记基因，如18S rRNA或内源转录间隔（ITS）区域进行分析。

2. 宏基因组测序：宏基因组测序不依赖于传统的微生物培养或特定的标记基因，能够直接从肠道样本中获取所有微生物的DNA信息，包括细菌、古菌、真菌、病毒等。宏基因组测序技术基于高通量测序平台如 Illumina、PacBio 或 Nanopore 等，涉及更高的测序深度和复杂的生物信息学分析。其不仅能够获得分类学信息，还可获得微生物群落的功能潜力和代谢活动等［18］。此外，宏病毒组测序是研究肠道样本中病毒组的方法，包括噬菌体和真核病毒。Nayfach等［19］对来自11 810个人类粪便样本的宏基因组进行大规模的病毒基因组鉴定，其中包含189 680个病毒基因组，极大地扩展了肠道微生物组DNA病毒的多样性。

同时，宏基因组测序技术也具有相应的局限性，如样本的标化处理困难、宿主DNA的污染、测序覆盖度不均一及缺乏相应的参考基因组等，还有待技术的更新换代。

3.宏转录组学、宏蛋白质组学、代谢组学和宏病毒组学：宏基因组学作为一种强有力的分析工具，旨在阐述肠道微生物的遗传潜力。而宏转录组学、宏蛋白组学和代谢组学的发展，使得微生物群落功能活性的鉴定成为可能。

宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学是3种互补的方法，分别通过分析mRNA、蛋白质和代谢物组成，综合揭示微生物群落的即时功能状态、微生物活性及代谢途径，以及它们与宿主间的代谢交互作用［20⁃22］。然而，相应参考数据库的不足仍是这些技术发展所面临的巨大挑战之一。

 单细胞测序技术通过分离并测序单个细胞的DNA或RNA，专注于解析单个细胞的基因表达和遗传信息，揭示细胞群体的遗传多样性。与群体水平的高通量测序相比，单细胞测序技术根据细胞的物理特性、化学组成或分子标记进行精确分离，提供更精细的细胞级数据，帮助深入理解微生物个体的特性、功能及其与宿主的相互作用。目前，用于肠道微生物的单细胞分选方法主要包括流式细胞分选、微流控芯片技术、激光捕获显微切割、拉曼光谱分析以及荧光原位杂交等。Shen等［23］开发了高通量单细胞转录组测序技术，通过该技术捕获了利用琥珀酸考拉杆菌（Phascolarctobacterium succinatutens）并鉴定出其中3个主要的细菌亚群，揭示了同一菌种在人类肠道中的功能异质性。同时，单细胞测序技术的应用能够精确解析菌株水平基因组，发现潜在的未培养的新菌株［24］。尽管面临技术挑战和高昂的成本，单细胞测序的潜力和应用前景在肠道微生态研究领域中仍是无可比拟的。

 在肠道微生态研究中，生物信息学分析不仅可以处理高通量测序技术产生的数据，如16S rRNA基因测序宏全基因组测序数据，还可以通过多组学联合分析手段，整合不同来源的数据，以获得更全面的微生物群落功能和微生物⁃宿主关系［25］。特别值得一提的是，由哈佛大学Huttenhower实验室开发的Biobakery 作为一个功能强大的开源项目（https：// gitcode. com/biobakery/biobakery）［26］，提供了从 16S rRNA基因分析到宏基因组及宏转录组的全套分析流 程 。BioBakery 集 成 了 微 生 物 丰 度 评 估 工 具MetaPhlAn、功能注释工具HUMAnN，以及差异丰度分析工具 LEfSE 等，为人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP）等大规模研究的数据后处理提供标准化和验证的方法。Huttenhower研究团队采用该分析工具对132例IBD及非IBD肠炎受试者1年内多个时间点的粪便、活检和血液样本进行纵向多组学分析，全面揭示IBD相关的肠道菌群及其功能失调、宿主和菌群的分子互作关联，对于阐释IBD发病机制、寻找防治新靶点有重要价值［25］。

肠道微生态研究是一个高度跨学科的领域，需要综合运用多种研究策略，见图 2。从临床样本的收集到动物模型的建立以及实验中相应的干预策略，都需要在研究设计中予以考虑。

 临床研究是理解肠道微生态与人类健康关系的直接途径。横断面和纵向队列研究能够鉴定与特定疾病相关的微生物标志物，同时追踪肠道微生物群落的动态变化，阐明其与疾病进程之间的联系［27］。HMP 由美国国立卫生研究院（NIH）在 2007年发起，目标在于构建健康人体微生物群落的基线，并探索其与健康和疾病的关联。该计划揭示了微生物的多样性和部位特异性，定义健康人群的“核心微生物组”。综合人类微生物组计划（Integrative Human Microbiome Project，iHMP）作为 HMP 的第二阶段，进一步通过纵向研究深化人们对微生物组在在妊娠、早产、IBD和糖尿病前期等关键健康问题中作用的理解。

肠道微生态的临床研究策略侧重于直接从患者群体中获取数据和样本，以研究肠道微生物与人类健康的关系。因此，样本的收集、处理、保存和运输条件必须标准化，以保持微生物群落的原始状态［28］。此外，对照的选择对于发现差异微生物来源标志物也至关重要。Chen等［29］通过比对CD患者与其健康同住亲属的肠道菌群，提高差异微生物检测灵敏度，有助于鉴定出更可靠的 CD 相关微生物标志物。

 动物模型是研究肠道微生态的另一个重要工具。主要包括常规SPF小鼠模型和无菌小鼠模型两大类。常规动物模型通过使用广谱抗生素来减少或消除动物胃肠道中的大部分肠道微生物，构建伪无菌小鼠。无菌小鼠则不携带任何微生物。利用（伪）无菌小鼠模型，研究者可以观察这些微生物如何在宿主体内定植，以及它们如何影响宿主的生理和免疫功能。此外，粪菌移植（fecal microbiota transplantation， FMT）是研究肠道微生物群在疾病中因果作用的常用策略［30］。然而，无菌小鼠需昂贵的无菌环境，生理和免疫可能不完善，影响研究精确性。同时无菌小鼠对病原体更敏感，微生物群重建难以完全模拟正常生理状态。

 1.FMT：FMT 是一种新兴的肠道微生态干预手段，临床上多用于治疗如复发性艰难梭菌感染、IBD等肠道疾病［31］。一项随机安慰剂对照试验表明，CD患者的 FMT 治疗组较安慰剂组具有更高的临床缓解率和更低的C⁃反应蛋白水平［32］。在动物水平上，可通过 FMT 直接研究肠道菌群与人类健康或疾病的因果关系［30］。

2.益生菌、益生元与合生元：益生菌（probiotics）是指能够通过补充人体有益菌进而改善肠道微生物平衡的活菌制剂，常见的益生菌有双歧杆菌、乳酸 菌 、嗜 酸 杆 菌 及 罗 伊 乳 杆 菌 等［33］。益 生 元（prebiotics）是促进益生菌生长和活动的食物成分，可作为调节微生物群的一种饮食策略。人体消化酶无法消化益生元中复杂的碳水化合物和植物多糖，然而这些多糖能够被肠道微生物代谢，继而产生短链脂肪酸维持宿主的肠道健康［34］。合生元（synbiotics）是益生菌和益生元的联合制剂，益生元能 够 增 加 益 生 菌 在 宿 主 肠 道 中 的 定 植 机 会 。Lactiplantibacillus plantarum 与壳聚糖结合的合生元，能减轻小鼠结肠炎的症状，抑制葡聚糖硫酸钠（DSS）引起的短链脂肪酸、炎性细胞因子和髓过氧化物酶的变化［35］。

3.噬菌体疗法：噬菌体疗法在肠道微生物干预方面展现巨大的潜力。噬菌体能够侵袭特定病原细菌，减少对其他共生菌的影响，且降低细菌产生耐药性的风险［36］。Pirnay等［37］对首批来自12个国家35家医院的100例个性化噬菌体治疗患者进行回顾性观察分析，结果显示 77.2% 患者获得临床改善， 61.3%患者目标细菌被根除。

4.合成微生物和合成微生物群落：合成微生物及其群落是肠道微生物研究的前沿领域，通过人工设计具有特定功能的微生物或微生物组合，为精确模拟和研究肠道微生物与宿主健康之间的复杂关系提供新工具，促进精准医疗的发展。Zou 等［38］基于 Escherichia coli 开 发 了 一 种 工 程 益 生 菌（i ⁃ ROBOT），用于IBD小鼠的非侵入性诊断、监测和治疗。i⁃ROBOT具备荧光报告、基因编辑和药物释放功能，能够响应炎性标记物硫代硫酸盐，激活编辑系统，产生比色变化并释放免疫调节剂，实现结肠炎 的 诊 断 和 症 状 缓 解 。Altered Schaedler Flora （ASF）作为合成微生物群落研究的开创性模型之一，揭示营养对细菌生长和病原体抗性的影响，对肠道菌群研究具有重要意义［39］。此外，ASF的成功也催生了其他合成微生物群落的开发，如Oligo⁃Mouse Microbiota（OMM12）（12种）［40］、GM15（15种）［41］以及SIHUMI（7 种）［42］。斯坦福大学的 Fischbach 研究团队创建一种融合 119 种细菌的合成人类微生物组，其能有效抵御病原体并促进小鼠免疫系统正常发展，提供与自然微生物组相似的功能，为微生物组研究设立新基准［43］。

本文回顾了肠道微生态研究的多种关键技术和研究策略，这些方法为理解肠道微生物群落与宿主健康之间的复杂关系提供强有力的工具。从传统的微生物培养技术到现代的高通量测序技术，再到精准的单细胞基因组学，每一种技术都揭示了肠道微生物世界的新维度。同时，还讨论临床研究、动物模型以及微生物干预措施在肠道微生态研究中的应用，这些策略将有助于从不同角度探索微生物群落的功能和影响。

综上，肠道微生态研究作为医学和生物学研究的前沿领域，其未来充满机遇和挑战，新兴技术的应用将推动人们对肠道微生物世界的深入理解。特别是随着个体化医疗和精准干预策略的发展，可根据个体的肠道微生物组成定制治疗方案，为治疗慢性疾病提供新的途径。此外，跨学科合作将促进对复杂生物系统的全面认识，整合微生物学、免疫学、营养学和临床医学等领域的知识以期将研究成果转化应用，为人类健康带来实际益处。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献略

本文图片均通过BioRender.com绘制