【LorMe周刊】原噬菌体参与细菌战争——小麦叶际广泛存在原噬菌体
文摘
三农
2024-12-24 14:00
江苏
作者：岳修枫，南京农业大学硕士在读，主要研究原噬菌体与土壤健康。
周刊主要展示优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍小麦叶际细菌中存在大量活性、多样性和功能均未知的原噬菌体。原文于2023年发表在《The ISME Journal》上。环境细菌中寄生着大量的原噬菌体，但它们的多样性和功能在很大程度上尚不清楚。该文章研究了从小麦旗叶中分离出的63株欧文氏菌和假单胞菌中的原噬菌体活性和多样性。通过引入和验证病毒诱导测序（VIP-Seq），作者识别并量化了12个自发诱导的原噬菌体的活性，发现一些叶际细菌在过夜培养中产生高滴度的病毒，在植物体内也观察到显著的自发诱导现象。测序结果和噬菌斑测定表明，大部分种内遗传多样性是由蚜虫欧文氏菌原噬菌体造成，并通过将细菌宿主分裂为不同的派系而广泛参与到微生物战争中，揭示了原噬菌体介导的微生物多样性的重要性。将自发诱导的活性原噬菌体与预测的原噬菌体比较时，还发现插入序列与非活性原噬菌体密切相关。总之，研究发现了植物叶际细菌中存在广泛且大量功能和多样性均未知的原噬菌体。识别原噬菌体是较为困难的，尽管一些生物信息学工具可以通过细菌基因组组装进行原噬菌体机器学习预测，但这些软件在确定原噬菌体活性、相对诱导率和诱导条件时具有局限性。当前量化诱导的原噬菌体有多种方法，例如传统的基于培养技术的噬菌斑测定，一些免培养技术（TEM、透射荧光显微镜、qPCR）以及通过全基因组鸟枪（WGS）测序序列比对到细菌组装体来识别原噬菌体活性。但这些方法都有各自的缺点，传统的培养组学需要易感宿主，免培养技术又受到数据检测极限的问题。基于此，作者提出并验证了Virion诱导分析测序(VIP-Seq)。通过量化封装DNA中的DNA浓度，结合读序比对和不一致读序检查，VIP-Seq能够高灵敏地鉴定或定量所有诱导的原噬菌体。将VIP-Seq和其他技术应用于从单一环境中分离出来的菌株集合并对叶际中的原噬菌体进行了研究并量化了它们的滴度，发现许多在过夜培养物中高度诱导，还利用小麦幼苗进一步证明，广泛的噬菌体诱导也可以在植物体内发生。最后，作者将得到的自发诱导的活性原噬菌体与之前使用生物信息学工具预测的原噬菌体进行比较揭示了插入序列IS(insertion sequence) 与非活性原噬菌体之间存在强烈的关联。一、利用病毒粒子诱导分析测序(VIP-Seq)鉴定和定量活性原噬菌体
作者使用VIP-Seq来鉴定和定量过夜细菌培养物上清液中的原噬菌体。简而言之，将细菌上清液浓缩并进行DNA酶消化，然后对包封的DNA进行定量，并将读序比对细菌宿主（图1）。在鉴定出每个细菌基因组中的活性原噬菌体后，使用公式估计每个细菌宿主中每个诱导的原噬菌体的滴度：诱导的原噬菌体基因组拷贝数/ml =(mDNA×NA)/(Mnt×Lprophage )×rpp/rtot
以诱导原噬菌体基因组拷贝数/mL计算诱导型噬菌体原滴度，其中为每1 mL过夜菌液的洗脱DNA总质量，为为阿伏伽德罗常数，为为DNA核苷酸的平均摩尔质量(617.96
g/mol/bp)，为诱导型原噬菌体原基因组长度，为映射到噬菌体原区域的reads数，为reads总数。
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图1 用于鉴定和定量细菌培养物中活性原噬菌体的VIP-Seq工作流程二、来自叶际的欧文氏菌和假单胞菌菌株含有高滴度自发诱导的多种原噬菌体作者从丹麦哥本哈根附近Høje Taastrup试验田种植的4个小麦品种(Sheriff、Heerup、Rembrandt和Kvium)的旗叶中分离出150株欧文氏菌和假单胞菌。对这些分离株进行测序，将其染色体组装成单个contigs。并使用PHASTER和VIBRANT对每个基因组的噬菌体含量进行生物信息学预测。使用VIBRANT prophage预测通过预测的前噬菌体含量来复制宿主，通过核苷酸相似性聚类，得到61个细菌簇。从每个聚类中随机选择一株细菌分离物进行进一步分析。2株未预测到噬菌体的分离株也被纳入其中，共63株菌株分布在5个物种水平的集群中。筛选出的63株菌分别在LB液体培养基中培养过夜。利用VIP-Seq技术，对每个培养中自发诱导的噬菌体(Spontaneously
Induced Prophages, SIPs)进行了研究。作者发现许多SIPs是在隔夜培养中高度诱导的，滴度高达3108/mL (图2A-B)。在一些菌株中，病毒粒子滴度甚至与菌落形成单位(CFU)计数相媲美；在蚜虫Z9_1株中，聚集的病毒粒子/CFU比率为0.32(图2C)。欧文氏菌和假单胞菌的SIP含量有显著差异(图2，A-C)。相比之下，六种假单胞菌菌株在过夜培养中似乎缺乏SIPs。欧文氏杆菌的病毒粒子聚集滴度高于假单胞菌。尽管在调整CFU浓度后这些差异有所减小(图2C)，但它们仍然显著。研究SIP基因组发现了许多共享的基因组片段，其中散布着未对齐的区域(图2D)。![]()
三、使用丝裂霉素C处理后发现了更多的有活性的原噬菌体作者用丝裂霉素C培养了5株菌株(E. aphidicolaB01.5,W09.2,B01.10,P. trivialis B08.3和W02.4)，丝裂霉素C是许多原噬菌体的DNA损伤诱导触发物。根据未经处理的过夜培养的VIP-Seq数据和对活体噬菌体的预测，W02_4之前被认为不含有活性的噬菌体。丝裂霉素C处理增加了先前鉴定的SIPs的滴度。在B08_3和W02_4中以大约1.5Î106个病毒粒子/mL诱导了新的21 kb的推测噬菌体。虽然VIBRANT并没有预测这两个区域是原噬菌体，但PHASTER确实预测了这些区域的活性原噬菌体。
为了验证诱导噬菌体的VIP-Seq定量，作者将其方案与未处理过夜培养的B01_5、W01_1、W02_4和毒力噬菌体T4的易感宿主上染色的VLPs的EPI计数和PFU计数进行了比较。在未处理的W02_4培养基中未发现SIPs，但发现了丝裂霉素c诱导的原噬菌体。除W02_4上清液外，VIP-Seq滴度与EPI计数符合良好，T4、B01_5和W01_1的EPI计数分别占EPI计数的54%、65%和19%(图3)。相比之下，PFU的变异性更大；当T4的斑块计数超过EPI计数时，B01_5和W01_1的PFU/EPI比率分别为4Î10-2和2.8Î10-5。由于这两个菌株都含有可能形成PFU的多个SIPs，作者对这两个指示菌株上的斑块进行了测序，以确定哪个SIP正在形成斑块(图3B，C)。在调整了过夜培养中噬菌斑的相对滴度后，调整后的PFU/EPI比率分别为1.05和1.3Î10-4，表明PFU只能有条件地用于量化诱导的原噬菌体滴度。特别的是来自Vibrant的非常长的原噬菌体基因组长度，部分原因是几对紧密排列的原噬菌体(即B01.5原噬体Glittertind_A和Skarstind_A，图3B)合并为单个原噬菌体预测。在W02_4上清液中，VIP-Seq和噬菌斑试验均为阴性，而EPI计数为2.5×104VLP/mL(图3A，D)。![]()
图3 VIP-Seq定量与斑块和荧光显微镜计数的比较在发现63个叶际分离出来的菌株中广泛存在SIPs后，测定了这些SIPs的宿主范围来研究其潜在的生态意义。虽然许多欧文氏菌上清液中的SIPs在从相同环境中分离的竞争菌株上显示出广泛的宿主范围(图4A)，但假单胞菌上清液未能产生单个可见的斑块。宿主范围存在显著差异，欧文氏菌上清液在0个(E. aphidicola B07.5)和27个(E. aphidicola Z9.1和Z9.3)竞争菌株上留下噬菌斑(图4B)。原噬菌体的敏感性也有相似的变化，从0(多个菌株)到30(E. aphidicola N2.3)。还有至少两个具有广泛裂解谱的例子，都是E .billingiae W05.1和新的E. sp菌株在E. aphidicola上留下噬菌斑。一些上清液在同一宿主上也显示出多种噬菌斑形态(如图4B中最左边的三个点分别对应于W11.1、Z9.1和Z9.3的上清液，分别含有2、3和4个已鉴定的SIPs)，表明可能有多个SIPs形成了噬菌斑。为了研究这些噬菌斑，作者使用DefenseFinder鉴定63株菌株，并鉴定出412种噬菌体防御系统，分为24种类型。为了进一步研究所有VIP-Seq鉴定的SIPs的防御特性，作者将欧文氏菌菌株分成15个“吞噬型”，这些“吞噬型”是由它们在属水平聚集的SIPs组合确定的。在相同吞噬型(或亚吞噬型)成员之间的上清相互作用中，1/223(0.45%)产生噬菌斑，而所有相互作用中有448/2025(22%)产生噬菌斑。这种保护是非常广泛的；即使使用聚集在50%核苷酸一致性的SIP来确定吞噬型，也只有4/364(1.1%)的相互作用产生噬菌斑。这些结果表明拥有这些原噬菌体的欧文氏菌拥有更强的防御能力。这些原噬菌体不仅塑造了细菌的遗传多样性，还可能驱动了细菌种群的适应性和进化，从而在细菌的进化历程中起到了关键作用。![]()
由于许多欧文氏菌菌株在体外产生高水平的SIPs，作者研究了这种情况是否也可能发生在植物中。利用菌株E. aphidicola B01_5，将B01_5的过夜培养物接种12日龄小麦幼苗的第一片叶子。作为对照，将洗涤后的无细胞的上清液接种在单独的幼苗上。接下来，监测了实验组和对照组5天的CFU和PFU(利用B01.10上的B01_5 SIP Glittertind_A斑块) (图5)。当无细胞对照的PFU在第二天降至检测限以下时，B01_5处理的PFU在所有五天中保持相对稳定(图5B)。事实上，在第0天和第3天之间，PFU甚至在统计学上显著增加，在第5天下降。PFU的这种相对稳定性与B01_5计数的CFU计数形成对比，B01_5计数在第0天到第5天之间下降了近三个数量级。由于这些不同的趋势，B01_5处理的PFU/CFU比率在时间线上变化很大。尽管PFU/CFU开始时远低于体外过夜培养的PFU/CFU比率(4.7×10-3)，但到了第三天，它已经攀升到体外比率的500倍以上(图5C)，显示出非常高的诱导率。
图5 E.aphidicola菌株在植物体内产生原噬菌体七、将SIPs与生物信息学预测的原噬菌体进行比较表明可能存在IS介导的原噬菌体失活然后，作者将鉴定的120个SIPs与PHASTER和vibrant预测的原噬菌体进行比较。检查这些工具能否预测到VIP-Seq识别的SIPs，发现Vibrant预测117/120个原噬菌体(0.98)和PHASTER预测109/120个原噬菌体(0.91)(图6A)。PHASTER和VERIFIANT都没有预测到可能的噬菌体Kalvehoegda_A。这两种工具的核苷酸精确度也相对较低，因为它们经常在VIP-Seq预测的序列外添加无关的宿主DNA。即使只考虑高置信度的原噬菌体预测，这些差异也是明显的，因为基因组大小和相对GC含量的分布与实验上活跃的原噬菌体不同(图6B，C)。除了预测>90%的SIPs外，PHASTER和Vibrant还预测了许多没有被观察到的SIPs的原噬菌体(图6D)。令人惊讶的是，一半(53%)的PHASTER预测完全缺乏结构基因注释，因此不太可能是可信的原噬菌体；事实上，这些预测都不是SIP(图6E)。此外，只有2/79（2.5%）同时具有结构基因和插入序列（IS）注释的预测原噬菌体是活性原噬菌体。这表明，IS元件的存在可能与原噬菌体的失活或驯化有关。进一步研究发现77/114（68%）具有结构基因而没有IS元件注释的PHASTER预测的原噬菌体被证实是活性原噬菌体。这暗示结构基因是原噬菌体活性的一个必要条件，而IS元件可能是原噬菌体失活的一个强烈指示。
原噬菌体活动在农业中的影响可能是巨大的。尽管温和噬菌体通常被认为不适合生防，因为它们倾向于整合为原噬菌体，但该研究发现许多叶际原噬菌体已经参与了细菌战。这些结果也强调了原噬菌体在设计有益微生物-合成菌群方面的重要性。尽管很少在这种情况下考虑，但许多合成菌群成员很可能含有活性的原噬菌体。其中一些可能会杀死致病菌株并促进有益群落的建立，而另一些可能会消除有益于植物的细菌或传播有害基因。无论如何，它们都不应被忽视。原噬菌体将传统的基于噬菌体的生物防治与基于细菌的合成菌群相结合，为下一代植物微生物组工程和可持续农业提供了一个潜在的工具箱。
原名：Widespread
and largely unknown prophage activity, diversity, and function in two genera of
wheat phyllosphere bacteria译名：小麦叶际细菌中存在大量活性、多样性和功能均未知的原噬菌体DOI：10.1038/s41396-023-01547-1通讯作者：Lars
Hestbjerg HansenLab of rhizosphere Micro-ecologyCompetition & Cooperation
