作者：王硕，南京农业大学博士在读，主要研究利用噬菌体防治土传病害。
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噬菌体基因组通过突变和水平基因转移迅速进化，以对抗不断进化的细菌宿主防御。这种军备竞赛的动态会使来自相似但存在地理隔离的生态系统的噬菌体之间出现分化。然而，几乎相同的噬菌体基因组可以在相隔数年和遥远的距离内重复出现，这表明许多噬菌体基因组是稳定存在的。本研究表明，在遥远、离散的水生生态系统中，具有几乎相同核心基因组的噬菌体通过拥有众多灵活的基因模块来保持多样性，其中泛基因组中同源基因交换产生了新的噬菌体变种。通过从不同的宏基因组中反复重建噬菌体基因组的核心和柔性区域，本研究发现每个位置的每个模块都有同源基因变种共存，然而，显性变种在每个模块中独立地重组变换。这些结果表明，在自然群落中，重组是噬菌体多样性的最大贡献者，允许各种宿主识别受体和对抗细菌防御的基因存在，使不同噬菌体共存。一、几乎相同的噬菌体基因组
为了鉴定广泛分布的噬菌体基因组，本研究使用了671个病毒基因组和来自斯瓦尔巴群岛、格陵兰岛和阿尔卑斯山冰晶石的基因组组装片段的数据集。通过将宏基因组reads映射到参考基因组（>90%同一性），本研究鉴定出257种（38%）存在于两个或多个区域的病毒（图1），50种存在于全部三个区域的病毒。![]()
二、MGI存在于大多数噬菌体基因组中
在噬菌体基因组中总共检测到2612个宏基因组岛屿（MGI，当使用噬菌体和原核参考基因组从其自然环境中招募宏基因组reads时，比对中通常会出现空白区域，即明显招募不足或无法招募任何reads，而基因组的其余部分则被接近99%核苷酸同一性的reads覆盖），MGI平均大小为448 bp（范围为100 bp至7 kb）（图1）。82%的噬菌体基因组中发现了MGI，每个参考基因组中约10%由MGI区域组成。当在三个或更多位置检测到相同的噬菌体时，MGI区域通常出现在同一基因中（图2和图3）。预计总共有3083个基因与≥10%的MGI重叠。其中，482个（16%）可以从GenBank、Pfam和UniProtKB数据库得到注释结果。MGI中最常见的基因是DNA甲基转移酶（MTases），占已知MGI基因的11%（n=51）。MTase保护噬菌体基因组免受特定宿主编码的限制性修饰（RM）系统的攻击。它们在MGI中的高频率表明它们是可变或可移动的基因。移动元件，如核酸内切酶、转座酶和内含肽是第二常见的基因（占所有MGI基因的10%）。大部分注释的MGI基因（19%）似乎与宿主识别和细胞入侵有关。包括假定的受体结合蛋白，如噬菌体尾部相关基因（n=36），以及C1q样结构域（n=3），它们是海洋噬菌体MGIs中常见的模式识别受体。噬菌体MGI中参与宿主识别基因的频繁出现表明，噬菌体正在适应侵染一系列具有不同EPS、细胞表面受体和碳水化合物屏障的宿主菌株。MGI中的许多其他基因（19%）参与DNA复制和修复，特别是DNA聚合酶和核糖核苷酸还原酶基因（RNR）。已知DNA聚合酶和RNR基因含有高频率的核酸内切酶，因此移动元件的插入和缺失可能会检测到与这些基因相关的MGI。本研究对cryoconite噬菌体基因组中MGI区域的分析与从单一位置对海洋噬菌体的研究基本一致，该研究检测了参与宿主识别基因中的MGI，包括碳水化合物结合、尾纤维和C1q结构域，以及大小终止酶亚基基因。然而，本研究结果的不同在于DNA甲基转移酶和核酸内切酶是cryoconite数据集中最常见的两个可变/移动噬菌体基因，核酸内切酶最常见很可能是由于本研究的数据集中包含了更小的MGI。![]()
三、MGIs代表灵活的同源基因
为了确定有缺口的MGI区域中存在新的DNA序列，本研究开发了一种计算机模拟方法，使用宏基因组学reads来填补噬菌体基因组中的缺口。本研究选择了两种广泛存在的噬菌体，它们拥有大量MGI区域，这些MGI区域存在于五个或更多的宏基因组数据中。这些噬菌体具有足够的覆盖深度，可以重建有缺口的MGI区域。第一个基因组是一个新的、环状的拟杆菌噬菌体基因组，基因组大小为76kb，在五个遥远的宏基因组中完全组装/重建；第二个是42kb的Mu样噬菌体基因组，在四个宏基因组中全部组装/重建。在读取基因图谱中，这两个基因组都显示出多个MGI缺口。Cryophage在格陵兰病毒宏基因组中招募了高达1%的宏基因组读数（约100万次读数）。所有Cryophage变种的核心基因组区域中的10kb连续核苷酸比对表明，基因组在位置之间共享99%的核苷酸同一性。对MGI中缺失的DNA序列的重建证实，它们包含高度分化的同源基因序列。每个重建的MGI核苷酸序列在宏基因组之间表现出不同的关系（图2）。然而，在尾部纤维结构域中，发现了五个不同的变种，在五个宏基因组中的核苷酸同一性<90%。同样，其他重建的MGI变体在地理位置之间表现出不同的关系（图2）。在Mu样噬菌体基因组中，基因重建中出现了类似的模式。噬菌体基因组在四个重建的变种之间具有几乎相同的基因排列，除了DNA包装模块中插入和删除DNA MTase的2kb可变区，以及将两个核酸内切酶插入Rep和DnaB蛋白的2kb区域（图3）。核心基因组与AB09的原始变种的核苷酸同一性为96-99.7%。MGI存在于尾部纤维下游1.7kb的基因中，该基因编码一种假定的受体结合蛋白（C1q结构域）。对包含C1q结构域的四个基因变体的分析显示，每个位置都有一个不同的变种，核苷酸同一性为54-69%（图3）。在尾部相关基因中，存在三种变种，来自同一冰川的两种噬菌体变种共享几乎相同的基因。在DNA包装模块中，大终止酶亚基（TerL）由两个相似的变种组成；ML09、ML10和ALP共享相似的TerL基因，而这些基因与原始AB09终止酶的核苷酸同一性仅为~60%。![]()
图3 Mu-样噬菌体招募和基因组重建
四、每个宏基因组中都存在多种基因变异
通过招募每个宏基因组中Cryophage和Mu样噬菌体的所有MGI基因变种，本研究确定，对于单个MGI基因，每个宏基因组中最多有五个变种共存（图4）。值得注意的是Mu样噬菌体中的C1q样假定受体结合蛋白。Mu样噬菌体在ML10宏基因组中共存在四种不同变种中的三种。同样，在Cryophage中，全部五个尾部纤维结构域变种均存在于GreenM宏基因组中（假设与每个参考变种的核苷酸同一性>90%）。这意味着每个宏基因组重建的MGI基因变种（图2和图3）代表了采样时最丰富的变种，然而，对于每个MGI，广泛分散的噬菌体之间的关系被打乱，变种的数量在每个MGI和宏基因组之间呈现变异（图4）。广泛可变的MGI核苷酸序列，在共享高达99%同一性的核心基因组中，其核苷酸同一性通常低至约40%，并且在分离的噬菌体变种中，几乎相同的基因以不同的组合重复出现，意味着重组事件导致了观察到的变异。这些事件在培养的噬菌体中有很好的记录，包括尾部纤维基因（改变噬菌体宿主范围的）、DNA MTases、噬菌体终止酶基因（TerS、TerL）、尾部刺突和受体结合蛋白。在30多年来对单一乳制品中的936组乳酸乳球菌噬菌体的一项研究中，重组被证明在产生核苷酸变异方面比竞争性突变高出24倍。一个稳定的核心噬菌体基因组被维持了30多年，其中拥有可变的基因互补，包括噬菌体结构蛋白、HNH核酸内切酶、噬菌体溶菌素和DNA聚合酶基因，这些基因是通过噬菌体全基因组的反复重组获得和转换的。![]()
图4 10个MGI区域的宏基因组招募
本研究利用了671个病毒基因组和来自斯瓦尔巴群岛、格陵兰岛和阿尔卑斯山冰晶石的数据集，对其中的MGI进行分析和注释，并对基因功能进行表征。聚焦所有样品中存在的噬菌体基因组，分别对其MGI变种进行分析及表征，揭示了基因重组对噬菌体多样性以及进化的重要作用，为挖掘噬菌体基因组提供了研究思路与理论指导。
论文信息
原名：Flexible genes establish widespread bacteriophage pan-genomes in cryoconite hole ecosystems
译名：冰冷海洋噬菌体基因组中的“活跃”基因
期刊：Nature Communications
DOI：10.1038/s41467-020-18236-8
发表时间：2020.9
通讯作者：Christopher M. Bellas
通讯作者单位：University of Innsbruck
南京农业大学-土壤微生物与有机肥料团队
微生态与根际健康实验室
Lab of rhizosphere Micro-ecology
立足国家重大需求，探索前沿学科交叉
创新根际微生态研究、培养产教研创新人才
提升环境土壤生物一体化健康
竞争求发展，合作谋共赢
Competition & Cooperation
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