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真菌和细菌广泛共存于多种环境中，其相互作用被认为是农业生态系统中的普遍现象。这些微生物群落的关键物种（keystonetaxa）通过促进真菌与细菌群落间的连接，从而对其组成和功能产生重要影响。丛枝菌根（arbuscularmycorrhizal,AM）真菌与大多数植物根系可以形成共生关系，并在土壤中形成密集的菌丝网络。菌丝表面（即菌丝际）是一个重要的微生物交互作用区域，其中微生物可以通过代谢物的交换进行相互作用。然而，AM真菌菌丝际关键物种的存在及其功能的重要性仍知之甚少。本研究通过AM真菌的体外培养与盆栽系统，探讨特定关键细菌是否能够调控菌丝际微生物群落的组成，并潜在地提高AM真菌宿主的适应性，结果发现：AM真菌能够选择性招募链霉菌，以增强其磷营养，同时与磷转化能力较弱的细菌竞争。本研究揭示了关键细菌Streptomyces sp. D1在AM真菌菌丝表面介导真菌-细菌及细菌-细菌相互作用中的多功能性，为菌根微生物组的生态功能提供了新的见解。
一、链霉菌属是丛枝菌根真菌菌丝际中可培养细菌群落的关键类群
作者采集五个长期田间实验的土壤样本北京（BJ）、石河子（SH）、祁阳（QY）、泰安（TA）、乌鲁木齐（WL），提取土壤悬液，并接种至覆盖有RhizophagusirregularisMUCL43194菌丝室表面和无菌丝的对照组表面（对照处理）。在接种6天后，通过16SrRNA基因分析评估细菌群落的组成。结果发现，无论土壤来源如何，AM处理的细菌群落均以链霉菌属（Streptomyces）为主（图1A）。为探究此现象是否和AM真菌种类有关，采用相同的方法，作者比较了四种AM真菌（R.irregularisMUCL43194、R.irregularisMUCL41833、RhizophagusclarusMUCL46238和R.intraradicesMUCL49410）菌丝与对照组在接种后第3天和第6天的细菌群落组成，所用土壤为BJ土壤。不论接种时间和AM真菌种类，AM处理后的细菌群落均以链霉菌属为主，而对照组的细菌群落则以假单胞菌属（Pseudomonas）为主（图1A）。为了确定AM真菌招募链霉菌属是否具有普遍性，作者收集了六篇文献的数据，比较该属在原土壤与菌丝际土壤中的相对丰度。结果显示，在AM真菌存在的条件下，链霉菌属的相对丰度显著增加（图1B），表明AM真菌倾向于招募链霉菌。通过细菌共现网络发现，在AM存在的条件下，识别出17个关键ASV，其中11个属于链霉菌属（图1C）。相比之下，在无AM条件下，共识别出31个关键ASVs，主要属于Variovorax、Pseudomonas和Nocardioides属（图1C）。研究者为研究AM真菌与细菌的相互作用机制，从R.irregularisMUCL43194的菌丝表面分离出62种细菌，并通过16SrRNA基因序列的97%相似性聚类筛选出20种菌株以消除冗余。这些分离菌株在菌丝表面的相对丰度范围为0.01%至10.01%（图1D和表S1）。值得注意的是，链霉菌Streptomyces sp. D1的相关ASVs在对照处理与AM处理中的平均相对丰度从5.62%增加至10.01%（图1D）。最后，作者构建了两个合成微生物群落（SynComs）（图1E）：SynCom20包含Streptomyces sp. D1，SynCom19不含该菌株。将这两个合成群落分别接种到覆盖或未覆盖AM的菌丝室表面，结果发现：无Streptomyces sp. D1的情况下（SynCom19），AM菌丝表面富集了12种菌株；而在含该菌株的情况下（SynCom20），仅富集6种菌株（图1E）。由于Streptomyces sp. D1的存在，SynCom19中AM富集的12种菌株中有7种细菌在SynCom20中生长受抑制（图1E，标注为星号）。在盆栽试验中，将SynCom20接种至土壤时，AM真菌存在条件下Streptomyces sp. D1的相对丰度超过50%，而无AM时则低于25%（图1F），明链霉菌属是AM真菌菌丝际关键微生物属。![]()
图1 A（左图）：AM菌丝（ERH）与对照组（Ctrl，即未接种ERH）在接种6天（DAI）后的10种最丰富细菌属的相对丰度（%）。细菌悬液来源于中国五个长期田间实验的土壤样本；（右图）：四种不同AM真菌（RhizophagusirregularisMUCL43194、RhizophagusirregularisMUCL41833、RhizophagusclarusMUCL46238、RhizophagusintraradicesMUCL49410）的菌丝外菌丝（ERH）或未接种ERH（Ctrl）的10种最丰富细菌属的相对丰度（%），分别为接种后第3天或第6天（DAI）。此部分仅使用北京采集的土壤样本；B：根据六篇文献的数据，分析了链霉菌属（Streptomyces）在未接种AM真菌的原土（−AMF）和存在AM真菌菌丝/孢子表面（+AMF）土壤中的相对丰度（%）。宿主植物包括胡萝卜、玉米、大豆、棉花和苜蓿，对应的AM真菌属为Glomus、Rhizophagus、Funneliformis和Gigaspora；C：细菌群落的共现网络展示了在控制组（−AMF）和菌丝外菌丝表面（+AMF）之间的显著相关性（ρ>0.65，P<0.01，以灰线表示）。圆形节点代表细菌扩增子序列变体（ASVs），灰色边表示两节点之间强且显著的相关性。关键ASVs（以黑边方形节点表示）分别在−AMF和+AMF条件下单独识别，定义为每个网络节点度数（与节点相关的边数）前5%的节点。ASVs根据所属细菌属的分类着色。两种共现网络旁边的柱状图显示了不同属关键ASVs的数量；D：在5种土壤类型和4种真菌物种中，与北京土壤细菌悬液中20种分离细菌匹配的ASVs在对照组（−AMF）或菌丝外菌丝（+AMF）处理中的平均相对丰度（%）；E：在两个合成微生物群落（SynComs，分别为SynCom19和SynCom20）中，细菌在RhizophagusirregularisMUCL43194菌丝外菌丝（+AMF）或无菌丝外菌丝（−AMF）条件下的相对丰度（%）。SynCom19由19种细菌分离株（不含Streptomyces sp. D1）组成，SynCom20包括19种细菌分离株加上Streptomyces sp. D1。在SynCom19中菌丝外菌丝富集的细菌分离株，而在SynCom20中因Streptomyces sp. D1存在而减少的分离株以星号标注；F：20种细菌分离株在含菌丝外菌丝或无菌丝外菌丝（SynCom20）条件下的相对丰度（%），实验在盆栽系统中进行。
二、链霉菌Streptomyces sp. D1对海藻糖作为碳源表现出偏好
为探究链霉菌与AM真菌互作机制，作者检测了20 种细菌利用AM 真菌菌丝分泌物中的主要化合物（果糖、葡萄糖、海藻糖、肌醇、柠檬酸和琥珀酸）的情况。结果显示，大多数细菌能够在至少一种碳源存在下生长，并表现出对葡萄糖、琥珀酸或柠檬酸的偏好。其中，链霉菌Streptomyces sp. D1能够利用所有六种碳源，并对海藻糖表现出显著的偏好（图2A）。对链霉菌Streptomyces sp. D1的全基因组测序表明，该菌株拥有编码海藻糖运输（ThuE、ThuF、ThuG和MalK）及代谢（OtsB、TREH、TreZ、TreS和glvA）的相关基因（图2B和表S2）。转录组测序进一步揭示，在RhizophagusirregularisMUCL43194菌外菌丝（ERH）存在的条件下，链霉菌Streptomyces sp. D1的与海藻糖代谢相关的基因表达显著上调。特别是，α-海藻糖酶基因TREH（负责将海藻糖转化为葡萄糖）和多磷酸葡萄糖激酶基因ppgK（负责将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷）均表现出显著的表达增强（图2B）。![]()
图2 A：链霉菌Streptomyces sp. D1在M9最小盐培养基中，以海藻糖、果糖、葡萄糖、琥珀酸、肌醇和柠檬酸为碳源的生长曲线；B：链霉菌Streptomyces sp. D1基因组图，展示AM真菌菌丝分泌的三种主要碳源（果糖、葡萄糖和海藻糖）的代谢通路，结合转录组数据的基因表达水平。具有显著差异表达（P<0.05，|log2FC|>1）的基因以箭头标注（代谢通路）或基因名称标记，绿色表示在与菌丝外菌丝（ERH）接触时下调，红色表示上调，灰色箭头表示未在路径中识别到基因；C：从RhizophagusirregularisMUCL43194的菌丝外菌丝表面（接种BJ土壤细菌悬液后）分离出的20种细菌的碱性磷酸酶（AP）生产效率。误差条表示五次独立重复的标准误差；D：链霉菌Streptomyces sp. D1和假单胞菌Pseudomonas sp. H2基因组中与磷循环相关的基因和碳水化合物活性酶（CAZy）基因的数量比较。
三、链霉菌Streptomyces sp. D1在菌丝际中表现出强大的有机磷矿化能力
测定在碳（10 mM 葡萄糖）和磷（50 mM KH₂PO₄）限制条件下，20 种细菌分离株的碱性磷酸酶（AP）活性，根据AP活性的水平，将这些细菌分为高（>0.8）、中（0.4–0.8）和低（<0.4）三组（图2C）。其中，Streptomyces sp. D1表现出最高的AP生产效率，而Pseudomonas sp. H2 几乎表现出最低的AP生产效率（图2C）。基因组分析显示，Streptomyces sp. D1携带丰富的磷代谢相关基因，包括10个与有机磷矿化相关的基因，9 个与无机磷溶解相关的基因，14个与磷转运相关的基因，以及2个与磷代谢调控相关的基因（图2D）。此外，Streptomyces sp. D1的基因组中还包含与植物细胞壁多糖降解相关的基因（如GH6、PL1、PL3和PL9），而这些基因在R.irregularis基因组中缺失。总体而言，除调控基因外，Streptomyces sp. D1基因组中与磷代谢（无机磷溶解、有机磷矿化、磷转运）及纤维素/半纤维素降解（如糖苷水解酶GHs、糖基转移酶GTs、多糖裂解酶PLs）相关的基因数量均高于Pseudomonas sp. H2（图2D）。在BJ土壤中，Streptomyces sp. D1和Pseudomonas sp. H2分别为AM真菌菌丝存在和不存在条件下细菌群落的优势种。为探讨AM真菌影响Streptomyces sp. D1和Pseudomonas sp. H2有机磷转化能力的机制，作者测定了两种细菌在R.irregularisMUCL43194菌丝（ERH）存在与否条件下的转录组。结果发现Streptomyces sp. D1和Pseudomonas sp. H2分别有768和1159个差异基因。两种细菌中，与糖酵解和三羧酸循环相关的能量代谢基因表达均显著上调，表明AM真菌向细菌提供了大量碳源（图S2A、B）。在Streptomyces sp. D1中，果糖磷酸转移酶基因fruA和α-海藻糖酶基因 TREH的表达上调（图3A），表明菌丝分泌的果糖和海藻糖被细菌吸收，从而激活糖酵解和三羧酸循环通路基因。此外，其无机磷转运基因（如pstS、pstC和pstB）的表达下调（图3A）。相比之下，Pseudomonas sp. H2中与糖酵解、三羧酸循环及戊糖磷酸途径相关的基因显著上调（图3B），同时其无机磷转运基因（如pstS、pstC、pstA和pstB）也显著上调（图3B）。然而，两种细菌的无机磷溶解基因（gcd/gdh）及有机磷矿化基因（phoD）的表达均未发生显著变化（图3A、B）。总体而言，与Streptomyces sp. D1相比，Pseudomonas sp. H2中碳代谢（糖酵解、三羧酸循环、戊糖磷酸途径）和磷代谢（嘌呤代谢、嘧啶代谢）通路的更多基因被上调（图3C）。此外，Sec 分泌系统（包括secA、ftsY、secYEG、secDF、yajC和yidC等基因）在两种细菌中均普遍存在，在ERH存在条件下，Streptomyces sp. D1和 Pseudomonas sp. H2中secY和yidC基因的显著上调（图3A、B），这与其AP活性显著增强相一致。值得注意的是，Streptomyces sp. D1的AP活性在ERH条件下比Pseudomonas sp. H2高出37倍以上（图3D）。此外，在ERH分泌物的存在下，Pseudomonas sp. H2的89个细胞运动相关基因中有17个显著上调，表明其运动能力在ERH环境中得到激活。![]()
图3 A：链霉菌Streptomyces sp. D1的主要碳水化合物和磷酸盐代谢途径，基于转录组数据绘制。这些重建的代谢途径基于KEGG基因注释以及三次重复（每次重复由5个培养皿混合）的相对差异基因表达谱。具有显著（P<0.05）差异表达且|log2FC|>1的基因通过箭头标注路径，基因名称以颜色区分：绿色表示在与菌丝外菌丝（ERH）接触时下调，红色表示上调，紫色表示在接触ERH时部分基因下调，部分基因上调；B：假单胞菌Pseudomonas sp. H2的主要碳水化合物和磷酸盐代谢途径，通过与Streptomyces sp. D1相同的方法进行重建和标注；C：链霉菌Streptomyces sp. D1和假单胞菌Pseudomonas sp. H2中，与ERH接触相比对照组条件下，上调的碳和磷相关基因的数量；D：链霉菌Streptomyces sp. D1和假单胞菌Pseudomonas sp. H2在与RhizophagusirregularisMUCL43194菌丝外菌丝接触（+AMF）或未接触（−AMF）条件下的碱性磷酸酶（AP）活性（n=3，每次重复由五个培养皿混合）。图中标注：Ps为Pseudomonas sp. H2，St为Streptomyces sp. D1。
四、Streptomyces sp. D1促进了AM真菌对有机磷的利用并激活了植物中碳-磷交换相关基因的表达
链霉菌Streptomyces sp. D1和假单胞菌Pseudomonas sp. H2在与RhizophagusirregularisMUCL43194的菌丝外菌丝（ERH）接触的条件下，其植酸磷的消耗量显著高于未接触ERH的情况（图4A）。此外，在ERH存在下，Streptomyces sp. D1的植酸磷消耗量几乎是Pseudomonas sp. H2的两倍，而在没有ERH时，Streptomyces sp. D1的消耗量是Pseudomonas sp. H2的六倍（图4A）。作者测定了有无细菌存在条件下的AM真菌转录组，结果发现在接种Streptomyces sp. D1的ERH中，与对照组（即未接种细菌的ERH）相比，Pi转运蛋白（Pho84）、液泡磷酸盐转运蛋白（Pho91）以及液泡转运伴侣（VTC2和VTC4）的基因表达显著增加（图4B）。相反，在接种Pseudomonas sp. H2时，VTC2和VTC4基因表达显著下调，而Pho84和Pho91的基因表达与对照组相比无明显差异（图4B）。此外，在AM真菌的26143个基因中，有超过1.6%（434个基因）受Streptomyces sp. D1的影响。其中，20个与磷酸盐和多磷酸转运及代谢相关的基因表达普遍增加，包括调控磷限制的Pho80、磷酸盐转运的Pho84，以及多磷酸合成/分解的VTC2、VTC4和PPN1（图4C）。在Streptomyces sp. D1存在下，与多磷酸相关的离子转运基因（如ZRT1锌调节转运蛋白1、MatA镁转运ATP酶和VIT1液泡铁转运蛋白）的表达显著上调。同时，NAD(P)H合成和氧化还原相关基因的表达也有普遍增加（图4C）。细菌对AM真菌的作用还可以扩展到植物中。在菌丝际接种Streptomyces sp. D1后，植物中ATP酶基因MtHA1（在共生界面向植物转运磷的重要基因）的表达显著增加。同样，与脂肪酸合成（WRI5a和MtFatM）及脂肪酸向共生界面转运（STR2）相关的基因表达也显著提高（图4E）。相比之下，假单胞菌Pseudomonas sp. H2在菌丝际接种后也能显著提高植物中WRI5a和STR2的表达，但对MtFatM和MtHA1基因的表达没有明显影响（图4E）。![]()
图4 A：在有（+AMF）或没有（−AMF）RhizophagusirregularisMUCL43194菌丝外菌丝（ERH）条件下，链霉菌Streptomyces sp. D1和假单胞菌Pseudomonas sp. H2对植酸磷（Phytate-P）的消耗量；B：Pho84、Pho91、VTC2和VTC4基因在R.irregularisMUCL43194的ERH中，在无细菌对照组（Ctrl）以及接种链霉菌Streptomyces sp. D1或假单胞菌Pseudomonas sp. H2条件下的基因表达情况（n=3次生物学独立重复，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，LSD检验）；C：接种链霉菌Streptomyces sp. D1后，与未接种细菌的真菌相比，在R.irregularisMUCL43194中显著上调的磷酸盐、多磷酸及能量周转相关基因的汇总。具有显著（P<0.05）差异表达且log2FC>1的基因以红色标注；D：在接种链霉菌Streptomyces sp. D1与未接种细菌的对照条件下，R.irregularisMUCL43194菌丝外菌丝（ERH）中差异表达的基因数量（P<0.05，|log2FC|>1），分为细胞组成、生物过程和分子功能三大类别；E：在无细菌（Ctrl）、接种链霉菌Streptomyces sp. D1或假单胞菌Pseudomonas sp. H2的条件下，与R.irregularisMUCL43194的ERH相关的苜蓿（Medicagotruncatula）中WRI5a、MtFatM、STR2和MtHA1基因的表达情况（n=4次生物学独立重复，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，LSD检验）。
五、链霉菌Streptomyces sp. D1对菌丝际细菌群落的影响
为评估链霉菌Streptomyces sp. D1对菌丝际其它细菌的影响，作者检测了Streptomyces sp. D1的分泌物对19种细菌生长的影响。结果显示，Streptomyces sp. D1的分泌物抑制14株细菌的生长，包括假单胞菌Pseudomonas sp. H2（图5A）。值得注意的是，碱性磷酸酶（AP）生产效率较高的菌株（>0.4mMpNPh⁻¹OD600⁻¹）基本未受影响或仅受到轻微抑制（图5B）。在BJ土壤中，链霉菌Streptomyces sp. D1与假单胞菌Pseudomonas sp. H2之间存在负相关关系。通过qPCR发现，在没有ERH的情况下，Streptomyces sp. D1和Pseudomonas sp. H2的绝对丰度比显著下降。在ERH处理中，无论是单独培养还是双重培养，Streptomyces sp. D1的菌落发育都优于对照处理（图5C、D）。此外，Streptomyces sp. D1的培养细胞和分泌物均能够抑制Pseudomonas sp. H2的正常生长（图5E）。对链霉菌Streptomyces sp. D1基因组进行分析，发现其拥有完整的albaflavenone（杀菌性抗生素）合成途径基因（图5F、G）。与此一致，链霉菌Streptomyces sp. D1中与萜类骨架生物合成相关的基因表达普遍增加，这些基因是albaflavenone前体物质合成所必需的（图5G）。此外，通过UPLC-MSMS检测发现，在1/2TSB培养基中培养的Streptomyces sp. D1中，浓度为0.93µgL⁻¹的albaflavenone（C15H22O）被鉴定为与标准品（CAS:157078–47-2）一致（图5H）。![]()
图5 A：链霉菌Streptomyces sp. D1的分泌物对从RhizophagusirregularisMUCL43194菌丝外菌丝（ERH）表面分离的19种细菌的生长抑制作用，这些细菌是在与BJ土壤细菌悬液接触的培养条件下分离出来的；B：19种从ERH表面分离的细菌的生长抑制情况与其磷酸酶生产效率的相关性分析；C：链霉菌Streptomyces sp. D1和假单胞菌Pseudomonas sp. H2分别单独培养或联合培养时，在与R.irregularisMUCL43194的ERH接触（+AMF）或未接触（−AMF）条件下的绝对丰度（n=4次生物学独立重复，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，LSD检验）；D：在双重培养条件下，ERH存在（右柱）或不存在（左柱）时，链霉菌Streptomyces sp. D1和假单胞菌Pseudomonas sp. H2绝对丰度的比值；E：链霉菌Streptomyces sp. D1（上图）或其发酵液（下图）对假单胞菌Pseudomonas sp. H2（Ps）在固体培养基（0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.5%NaCl、0.8%琼脂）中的影响。对照组（Ctrl）使用0.9%NaCl溶液（w:v）或TSB培养基；F：通过antiSMASH6在链霉菌Streptomyces sp. D1基因组中检测到的albaflavenone（杀菌性抗生素）生物合成基因簇；G：链霉菌Streptomyces sp. D1的萜类骨架生物合成及倍半萜和三萜生物合成途径的重建图，结合转录组数据。代谢途径基于KEGG基因注释以及三次重复（每次重复由5个培养皿混合）的相对差异基因表达谱。具有显著（P<0.05）差异表达且log2FC>1的基因路径以红色标注（与ERH接触时上调）；H：对在1/2TSB培养基中培养的链霉菌Streptomyces sp. D1提取代谢物的UPLC-MSMS分析。UPLC-MSMS色谱图包括albaflavenone标准品（上图）和链霉菌Streptomyces sp. D1在TSB（胰蛋白胨大豆）培养基中的代谢物（下图）。
本研究揭示了Rhizophagus属AM真菌与Streptomyces sp. D1的互作机制。首先，AM真菌通过分泌碳源招募链霉菌定殖于菌丝表面，而Streptomyces sp. D1凭借其抗生素的产生能力，抑制了磷矿化能力较弱的细菌，进而调控菌丝际微生物群落的结构和功能，增强了AM真菌对磷的吸收。本研究突出了关键细菌Streptomyces sp. D1在AM真菌菌丝表面真菌-细菌及细菌-细菌相互作用中的多功能性，为菌丝际微生态功能的调控机制提供了新的视角。![]()
图6 AM真菌与细菌之间以及细菌-细菌之间在AM真菌菌丝表面复杂互作的示意图
论文信息
原名：Arbuscular mycorrhizal fungi and Streptomyces: brothers in arms to shape the structure and function of the hyphosphere microbiome in the early stage of interaction
译名：丛枝菌根真菌与链霉菌：协同塑造菌丝际微生物群早期互作的结构与功能
期刊：Microbiome
DOI：10.1186/s40168-024-01811-2
发表时间：2024年5月
通讯作者：Lin Zhang
通讯作者单位：中国农业大学
南京农业大学-土壤微生物与有机肥料团队
微生态与根际健康实验室
Lab of rhizosphere Micro-ecology
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Competition & Cooperation
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