作者：王硕，南京农业大学博士在读，主要研究利用噬菌体防治土传病害。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍噬菌体与细菌的协同进化，原文于2022年11月发表在《Nature Communications》上。![]()
噬菌体和细菌之间的军备竞赛是遗传多样化的主要驱动力。然而，在实验室中重现这种持续的动态具有一定的挑战性；实验室条件下噬菌体-细菌的协同进化通常在充分混匀的环境中进行，可能会导致实验快速停滞，遗传变异很小。本研究在泳动平板上将运动型大肠杆菌与烈性噬菌体T7共培养，观察到具有多个遗传多样性适应周期的复杂动态变化。通过系统性量化进化细菌和噬菌体分离株之间的10000多组抗性侵染表型，本研究观察到一个复杂的相互作用网络，包括宿主范围的扩大和宿主切换的权衡。这些进化的噬菌体和细菌分离株的全基因组测序揭示了多种遗传途径中丰富的适应性突变，包括以前与噬菌体-细菌相互作用无关的基因。综合重建这些新突变，本研究发现了噬菌体通用和特异性抗性表型，以及与更经典的已知噬菌体抗性突变的强烈协同作用。这些结果强调了空间结构和迁移对驱动噬菌体-细菌共进化的重要性，为揭示不同噬菌体-细菌系统中的新分子机制提供了一个具体的研究体系。
一、泳动平板延时成像揭示了细菌-噬菌体共进化动力学
本研究首先建立了一个可以进行长期培养的共进化平台，在泳动平板的中心接种了细菌和噬菌体的混合物，用延时成像监测了它们的生长动态，并在四个重复的平板共进行15天的共进化。最初，细菌和噬菌体自发地共进化了七天（图1a，b），第七天吸取局部样本重新接种在新鲜的泳动平板上，再进行8天的共进化培养。与液体环境不同，进化并没有以细菌占主导地位而结束；通过分析像素强度的变化，观察到在培养终点时不同位置上的细菌和噬菌体存在差异（图1c，细菌和噬菌体占主导的区域分别为绿色和品红色）。计算局部（1.4毫米宽的正方形）像素强度变化的峰值数量，可以得到局部的生长和侵染周期。所有重复实验的周期中位数为2；然而，在几个不同的位置显示出更多的生长侵染周期（最多达12个；图1d，e）。相比之下，仅由4个细菌组成的对照组，泳动平板没有显示出多峰动力学现象，证实了噬菌体在这些循环中具有重要作用。虽然峰值振幅在初始共进化过程中逐渐降低（图1e），但转接后产生了强烈的生长-侵染周期和持续8天的共存，这表明在初始共进化结束时振幅的降低是由营养耗竭而不是生态进化停滞造成的。总的来说，泳动平板上的大肠杆菌和T7表现出持续15天的共进化和波动性动态，并且在任何时间点，这两个物种都没有在整体范围内占主导地位。![]()
图1 细菌-噬菌体在泳动平板上的共进化形成多个适应周期二、进化细菌-噬菌体分离株的相互作用通过军备竞赛和宿主切换实现表型多样化
本研究在初始和共进化实验的终点从所有平板上取样了多个位点（51个不同的位点：初始29个，持续共进化实验22个）。共获得了94个细菌分离株和112个噬菌体分离株。为了分别评估所有细菌和噬菌体分离株的进化抗性和侵染性表型，本研究在琼脂平板上使用高通量噬菌斑试验测定了细菌-噬菌体相互作用。对于每种相互作用，本研究都会自动量化生成一个反映噬菌斑大小和浊度的“侵染性评分”。最后，根据细菌和噬菌体侵染性评分的欧氏距离，通过层次聚类将细菌和噬菌体聚类到一个综合的交叉侵染矩阵中（图2a）。细菌和噬菌体至少分别分为9个和12个不同的表型（图2a）。这些表型中的许多个体在不同的重复中独立进化，表明了它们的共进化是平行的（图2a）。一些表型，特别是最具抗性的细菌类别和范围最广的噬菌体类别，主要在持续共进化实验中被鉴定出来，支持了军备竞赛的进化观点。为了进一步分析进化表型的网络结构，本研究利用了BiMat文库，发现与祖先型相比，进化的细菌扩大了它们的抗性谱，进化的噬菌体扩大了宿主范围。然而，一些噬菌体增加了对进化细菌的侵染性并具有专一性，同时显著降低了对野生型细菌的侵染力（“宿主切换”，图2b）。将侵染性评分与更直接的噬菌斑浑浊度进行比较，同样观察到类似的表型特征，包括宿主切换现象。总之，系统表型分析揭示了抗性和侵染性类别存在广泛多样性，显示了平行军备竞赛进化以及宿主转换动力学。![]()
图2 进化细菌和噬菌体之间互作的系统分析揭示多种不同类型的共存三、回归模型识别已知和未知噬菌体-细菌相互作用中的适应性突变
为了量化突变与侵染表型的关联，本研究建立了每个细菌-噬菌体互作的线性回归模型（图2a）。为了避免过拟合，使用Lasso技术求解该模型。细菌突变强烈倾向于与侵染性呈负相关，正如耐药性突变的预期（图3a）。这些导致耐药性的细菌突变包括LPS生物合成、胞外多糖产生（lon）、trxA和编码aceE的丙酮酸脱氢酶的突变，以及特异性结合T7 gp0.4的aceE。获得了几种抗性突变（与侵染性负相关的突变，图3a）的两个额外基因与大肠杆菌对T7的抗性无关，即渗透调节周质葡聚糖（OPG）生物合成蛋白opgG和膜间磷脂转运蛋白mlaA。mlaA突变中虽然四分之三的突变为负系数，但有一个突变为正系数（图3a），这种插入序列突变破坏了mlaA基因。同样，最高的正系数被分配给gmhA中的插入序列突变（图3a），该突变预计会导致短LPS表型（多糖链的长度相对较短）和野生型背景下T7抗性的增加。在与侵染性的正相关中，这种突变出现在携带mlaA亚基插入的分离株（Bac71）中，与携带类似mlaA突变和野生型gmhA的其他分离株相比，其敏感性增加。由于gmhA对LPS生物合成至关重要，mlaA突变对磷脂转运的影响可能被突变的gmhA在LPS产生中的有害作用所抵消。与细菌突变相比，噬菌体突变包括更多与侵染性呈负相关的突变（图3b），这可能是由于宿主切换（图2b）等强非线性因素以及采集平板上不适合侵染的噬菌体基因型的能力有限。噬菌体突变包括尾部纤维基因gp17的突变，也包括尾部管状基因gp11和gp12的突变，甚至包括分别编码DNA喷射蛋白和RNA聚合酶的gp16和gp1等非结构基因的突变。在宿主范围显著扩大的单个噬菌体分离株中检测到与侵染性高度相关的5个突变组合，包括gp1（T23A）、gp2（D12G）、gp16（I197T）和gp11（E164A）中的SNP以及gp11中的结构内插入序列（图3b）。最后，在互补的平行进化分析中，还发现了相同的关键基因集，包括噬菌体尾部基因、LPS和EPS生物合成基因，以及新发现的mlaA和opgG，这些基因的突变超过了预期的偶然性，这些基因可能是驱动适应性进化的动力。![]()
图3 Lasso回归分析确定影响噬菌体-细菌相互作用的突变四、mlaA和opgG突变的遗传重建表明这些基因在噬菌体抗性中的新作用
本研究基于合成重建和竞争表型分析证实了新发现的mlaA和opgG突变的噬菌体抗性。聚焦mlaA基因，利用表达特异性结构内缺失的质粒转化的菌株（以前被报道为显性功能获得突变），在野生型噬菌体存在的情况下，与野生型细菌菌株相比具有温和但稳健的优势（图4a）。此外，由于存在支持噬菌体侵染的敏感菌株，单独测量的独立抗性表型可能比噬菌斑实验中观察到的更大。聚焦opgG基因，综合重建进化实验中观察到的无义突变（图3a），本研究最初观察到，与野生型噬菌体的祖先背景相比，仅具有轻微的抗性优势（图4b）。然而，所有opgG突变的分离株在LPS葡萄糖基转移酶waaJ基因中也携带了额外的突变，随后构建了一个携带opgG和waaJ突变的双突变体。虽然这种waaJ突变本身也只引起轻微的表型，但这两种突变显示出强烈的协同作用；当添加到waaJ突变背景上时，opgG突变具有很强的抗性表型（图4b）。此外，本研究还发现，当面对一些进化的噬菌体时，opgG突变本身就足以产生明显的抗性表型（图4c，d）。总体而言，这些结果表明opgG和mlaA在T7耐药性中起着新的作用。![]()
图4 opgG或mlaA重建突变获得T7抗性，并与LPS生物合成突变相互作用
本研究以大肠杆菌及其噬菌体为研究对象，通过构建长期共进化平板培养体系，从试验的不同时间点分离出大量的细菌和噬菌体。借助回归模型对细菌-噬菌体互作网络进行了解析，发现了两个与噬菌体抗性相关的基因并进行验证。本研究为细菌-噬菌体共进化研究提供了一种新的研究体系，强调了空间和迁移在共进化过程中的重要作用，推动了细菌-噬菌体共进化的研究。
论文信息
原名：Multistep diversification in spatiotemporal bacterial-phage coevolution
译名：细菌-噬菌体协同进化的多样性
期刊：Nature Communications
DOI：10.1038/s41467-022-35351-w
发表时间：2022.11
通讯作者：Roy Kishony
通讯作者单位：以色列理工学院
南京农业大学-土壤微生物与有机肥料团队
微生态与根际健康实验室
Lab of rhizosphere Micro-ecology
立足国家重大需求，探索前沿学科交叉
创新根际微生态研究、培养产教研创新人才
提升环境土壤生物一体化健康
竞争求发展，合作谋共赢
Competition & Cooperation
感谢您的关注和支持！
