【LorMe周刊】“一个蛋白两种作用”——调控噬菌体免疫和宿主行为的噬菌体蛋白
文摘
三农
2024-12-10 14:00
江苏
作者：岳修枫，南京农业大学硕士在读，主要研究原噬菌体与土壤健康。
周刊主要展示优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍调控噬菌体免疫和宿主行为的噬菌体蛋白。原文于2024年发表在《Nature Microbiology》上。![]()
为保证自身的成功繁殖，噬菌体已经进化出多种策略来克服宿主防御系统并操纵细菌的生物合成。与此同时，细菌也进化出了大量抵抗噬菌体的元件，这些元件包括核酸酶、解旋酶、蛋白酶和激酶。其中，来自RM系统（限制性修饰）和CRISPR-Cas系统的核酸酶能切割噬菌体DNA，已被广泛研究。然而，蛋白酶在噬菌体防御中的作用却鲜有研究。本文作者从铜绿假单胞菌噬菌体PaoP5中鉴定出一种名为Dap1的噬菌体蛋白，该蛋白具有调节细菌宿主行为和防御Lon蛋白酶介导的新型噬菌体抵抗机制的双重作用。此外，Dap1能够提高噬菌体的生存优势、显著提升噬菌体治疗效率。在这篇文章中作者识别到噬菌体PaoP5中的蛋白Dap1并对该噬菌体蛋白进行了功能鉴定，发现Dap1能够调节细菌的游动和生物膜的形成并设计了相关实验，同时通过CRISPR-Cas9系统敲除PaoP5中的dap1基因来研究其对噬菌体适应性的影响，进一步评估Dap1的功能。与此同时作者发现Dap1在噬菌体逃避抗噬菌体免疫中起着重要的作用，并将Dap1运用到小鼠模型中评估其在噬菌体疗法中的作用。通过一系列的实验和分析，详细阐述了噬菌体蛋白Dap1在调节细菌行为和逃避宿主免疫反应中的重要作用，并探讨了其在噬菌体治疗中的潜在应用。一、噬菌体蛋白Dap1抑制细菌运动
首先鉴定了裂解性噬菌体PaPo5中的基因，发现其具有相对广泛的宿主范围（图1a）。细菌运动和生物膜是P. aeruginosa的重要毒力因素，因此作者首先探究了来自PaPo5中的60个假定orfs的生物活性并发现orf002、orf157、orf160、orf163、orf164、orf165或orf176在PAO1中的表达引发了显著的生长缺陷（图1b第一排），这表明这些基因产物对P. aeruginosa具有潜在毒性，而在这些基因产物之中，orf003（以下简称Dap1）过表达显著抑制细菌游动和聚集（图1b第二排）但不影响细菌生长，这表明Dap1的靶点应该是细菌活力蛋白。之后作者尝试使用RNA测序来深入探究Dap1如何影响细菌运动。dap1的表达导致了166个基因在指数生长过程中的差异调控。其中，PAO1/ P -dap1菌株中52个基因表达上调，114个基因表达下调（变化倍数>2，P < 0.05，图1c）。RNA-seq数据显示生物膜所需要的siaC和siaD在PAO1/p-dap1菌株中显著上调，因此进一步探究Dap1是否影响铜绿假单胞菌生物膜的形成。根据COMSTAT分析显示，与表达空载体的PAO1相比，PAO1/p-dap1菌株显著增加了生物膜产量(图1d)。这些数据表明Dap1能够调节细菌的毒力，而细菌的运动和生物膜的形成是由第二信使信号分子环二gmp (c-di-GMP)30反向调节的，作者假设Dap1通过与二胍酸环化酶(DGC)或磷酸二酯酶(PDE)的结合来调节细胞内c-di-GMP水平，从而控制这两种表型。为了验证这一假设，作者使用细菌腺苷酸环化酶双杂交(BACTH)试验来检测Dap1的潜在蛋白质结合伴侣。与此同时作者发现DipA、RocR或ProE与Dap1联合表达可导致高水平的β-半乳糖苷酶活性(图1e)，并通过使用共免疫沉淀(CO-IP)实验进一步验证了相互作用，发现Dap1仅与DipA (PA5017)共洗脱(图1f)，而不与RocR (PA3947)或ProE (PA5295)共洗脱，表明由Dap1表达引起的细菌行为改变是通过其与DipA的相互作用介导的。dipA的失活导致细胞c-di-GMP水平升高，抑制鞭毛运动转换和游动。与PAO1中dap1的表达类似，与野生型亲本菌株相比，ΔdipA突变体的生物膜形成增强，细菌游动和群体运动减弱(图1c)。考虑到Dap1与DipA相互作用，作者推断在铜绿假单胞菌中Dap1的表达可能会改变胞内c-di-GMP水平。为此，作者利用p-cdrA-lux报告基因融合检测了PAO1/p-dap1和空载体PAO1中c-di-GMP的水平，并通过使用液相色谱-质谱(LC-MS)进一步验证了结果(图1g)。正如预期的那样，dap1的表达没有改变ΔdipA菌株胞内c-di-GMP水平和细菌行为(图1b)。作者构建了铜绿假单胞菌感染的小鼠模型来研究噬菌体Dap1蛋白在PAO1发病机制中的作用，生存研究表明，感染PAO1/ pUCP的小鼠在2天内死亡80%，而感染PAO1/pUCP-dap1的小鼠在第5天的存活率为100%(图1h)。综上所述，这些数据表明噬菌体蛋白Dap1的表达抑制了铜绿假单胞菌的致病性。
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图1 噬菌体蛋白Dap1通过与c-di-GMP磷酸二酯酶相互作用调控铜绿假单胞毒力之后作者研究了Dap1在噬菌体适应性中的潜在作用。首先，作者使用RT-qPCR证实dap1是一个早期表达基因。紧接着使用CRISPR-Cas9系统删除PaoP5中的dap1基因，并以敲除orf014和orf153作为对照。作者发现PaoP5Δdap1形成了微小的噬菌斑，而PaoP5Δorf14和PaoP5Δorf153形成了类似野生型(WT)噬菌体的大斑块(图2a)。此外，PAO1中dap1的表达可以恢复PaoP5Δdap1的大斑块，而PaoP5Δdap1在PAO1/p-dap1中的EOP与PAO1/ EV中的相似(图2b)。这表明dap1对噬菌体适应性很重要。作者认为PaoP5Δdap1和WT噬菌体都能有效地与宿主结合(P > 0.05)，因此与宿主的结合并不是造成噬菌体差异的原因(图2c)。而由于噬菌斑大小与裂解有关，所以作者评估了两种噬菌体的裂解量大小。一步生长曲线实验表明，PaoP5Δdap1产生的后代比PaoP5少(图2d)。PaoP5和PaoP5Δdap1的裂解量大小分别为~104.95±17.14 pfu/细胞和14.52±3.62 pfu/细胞(图2e)。因此，PaoP5Δdap1产生的后代数量仅为野生型噬菌体PaoP5产生后代数量的~13.83%。由于Dap1抑制DipA，因此作者推断DipA可能限制PaoP5Δdap1的复制。然而，PaoP5Δdap1的小斑块形成表型在感染ΔdipA时不能被挽救，这表明尽管Dap1抑制DipA，但Dap1赋予的噬菌体适应性与DipA无关。图2 PaoP5Δdap1形成小噬菌斑，产生较少的后代由于dap1是一个促进噬菌体生产力的早期表达基因，作者假设PAO1中未知的噬菌体防御系统可能抑制噬菌体生产力，而dap1可以克服这种噬菌体防御系统。因此，作者使用蛋白质组学方法来表征Dap1对噬菌体蛋白(图3a)和宿主蛋白的影响。PaoP5Δdap1-infected PAO1中下调了两种噬菌体蛋白(Orf049, Orf050)。Orf050在PaoP5Δdap1-infected
PAO1中的丰度降低到约为PaoP5感染PAO1蛋白水平的十分之一(图3a)。Orf50为HNH内切酶，它是噬菌体DNA包装的重要组成部分。PaoP5Δdap1能够形成大斑块(图3b)，这表明HNH水平的降低对PaoP5Δdap1包装的减少有影响。而阴性染色的噬菌体裂解物的电子显微镜显示，由于噬菌体PaoP5Δdap1裂解物缺乏DNA包装，导致大量的噬菌体颗粒不含DNA，并且在PAO1中表达dap1或hnh完全恢复了DNA包装效率至野生型噬菌体水平(图3c,d)。这些数据表明，当PaoP5Δdap1感染PAO1时，噬菌体HNH内切酶显著降解，产生的后代也更少。![]()
图3 PaoP5Δdap1在基因组包装中效率较低
五、Lon蛋白酶保护PAO1抵抗PaoP5Δdap1以上数据都表明Dap1可能保护HNH内切酶免受快速降解。作者推断铜绿假单胞菌的蛋白酶Lon可能参与了HNH内切酶的降解。有研究表明Lon可切割大肠杆菌的原噬菌体蛋白。为了验证这一假设，作者使用PaoP5Δdap1感染野生型PAO1或Δlon，而数据表明PaoP5Δdap1在Δlon中形成的斑块比在PAO1中形成的斑块更大(图4a)。此外，电子显微照片显示，PaoP5Δdap1的大多数后代都被DNA包裹在Δlon中(图4b,c)。然后，作者通过4D无标记高通量蛋白质组学分析PaoP5Δdap1-infected
PAO1或Δlon，发现Lon对宿主蛋白有显著影响，鉴定出697个宿主蛋白为差异表达蛋白。在噬菌体蛋白中，PaoP5Δdap1-infected
Δlon中的HNH内切酶(Orf050)丰度明显高于PaoP5Δdap1-infected PAO1(图4D)，这说明没有Lon，噬菌体HNH内切酶无明显降解。上述结果暗示了铜绿假单胞菌Lon蛋白酶可能作为宿主编码噬菌体限制性蛋白的功能作用。作者发现Lon可以抑制铜绿假单胞菌噬菌体PaP_Se，因为在没有Lon的情况下，噬菌体滴度增加了约100倍(图4e)。然而，过表达dap1并不能提高PAO1中噬菌体PaP_Se的生产力，这表明Lon可能通过其他机制保护PAO1免受PaP_Se的侵害，而这些机制是噬菌体dap1无法克服的。总的来说，这些数据揭示了Lon蛋白酶作为噬菌体防御蛋白和抑制PaoP5Δdap1和环境分离噬菌体PAP_se的作用。
图4 Lon蛋白酶降低了HNH内切酶的丰度，抑制了PaoP5Δdap1噬菌体基因组的包装六、Dap1与HNH结合，阻止长链介导的HNH降解由于Lon蛋白酶降低了HNH内切酶的丰度，作者进行了体外实验，发现在Lon蛋白酶和激酶存在的情况下HNH内切酶被降解(图5a)。通过细菌双杂交(图5b)和Co-IP分析(图5c)均未发现Dap1和Lon之间的直接相互作用。由于Lon是一种重要的蛋白酶，如果Dap1直接与Lon结合并干扰其功能，作者预计过表达Dap1的PAO1会出现生长缺陷，但事实并非如此。因此，作者的数据表明Dap1不会与Lon结合以抑制其蛋白酶活性。随后作者提出Dap1可能与HNH内切酶结合以阻止长链介导的HNH降解。正如预期的那样，BACTH(图5b)和pull-down实验(图5d)都检测到了Dap1与HNH的结合，体外蛋白降解实验显示Lon降解了Dap1。然而，当Dap1与HNH预混时，Dap1-HNH混合物的降解减少(图5e)。总的来说，Dap1与HNH结合，保护其免受长链介导的降解。图5 Dap1结合HNH内切酶阻止长链介导的HNH降解为了进一步表征dap1对噬菌体适应性的影响，作者进行了竞争实验，发现PaoP5和PaoP5Δdap1的相对丰度分别为94.67%±2.62%和3.33%±2.62%(图6a)。此外，PaoP5Δdap1被另外两种环境分离的噬菌体打败(图6a)。总之，这一结果表明PaoP5Δdap1在与感染同一宿主的其他噬菌体竞争时处于明显的劣势，这表明dap1对Paop5类噬菌体在自然环境中的生存至关重要。作者随后利用小鼠模型进一步测试了Dap1对噬菌体治疗的影响。单剂量的PaoP5噬菌体在感染复数(MOI)为10时，可抑制100%的铜绿假单胞菌腹腔感染小鼠(图6b)。然而，当P. aeruginosa腹腔感染小鼠用单剂量噬菌体PaoP5Δdap1处理时，所有小鼠在7天内死亡，尽管小鼠表现出延迟死亡时间(图6b)。为了评估噬菌体耐药性是否是PaoP5Δdap1治疗失败的原因，从死亡小鼠中分离的200个菌落进行了噬菌体耐药性评估。总体而言，这些菌株中41%是噬菌体敏感的铜绿假单胞菌，39%是耐噬菌体的铜绿假单胞菌，而其他耐噬菌体菌株是肠道共生菌，它们可能在全身性细菌共感染后转移到肝脏。因此，在PaoP5Δdap1-treated小鼠中观察到噬菌体抗性突变，这也可能是导致小鼠死亡的原因。这些数据表明，dap1对噬菌体治疗的有效性至关重要，而自我复制以产生足够的后代来快速感染和清除细菌是噬菌体治疗成功的关键。接下来，作者检索了NCBI的同源基因，调查了dap1和hnh基因在铜绿假单胞菌噬菌体中的流行程度。截至2023年10月，785个测序的假单胞菌噬菌体中，有50个携带dap1同源基因，根据系统发育关系，48个同源性最低为90%的dap1样噬菌体基因聚为3支(图6c)。具体来说，dap1在pak_p1样噬菌体中相对保守，对于hnh基因，BLAST预测了99个hnh内切酶，与ORF050的同源性最低为30%，聚类为7个分支(图6d)。这些生物信息学分析表明，dap1样基因在铜绿假单胞菌噬菌体的一个亚群中是保守的。图6 Dap1对噬菌体的适应性和噬菌体治疗的有效性至关重要
该项研究深入揭示了噬菌体蛋白Dap1的双重功能：它不仅能够调控细菌的行为，而且还能帮助噬菌体逃避由细菌Lon蛋白酶所介导的噬菌体防御机制，显著提升了噬菌体的适应性和生存能力。这些发现不仅为我们理解噬菌体如何通过进化策略来增强其在宿主环境中的适应性提供了新视角，也为噬菌体疗法的开发和应用提供了潜在的新思路。
原名：Bacteriophage protein Dap1 regulates evasion of
antiphage immunity and Pseudomonas aeruginosa virulence impacting phage
therapy in mice译名：噬菌体蛋白Dap1调节抗噬菌体免疫逃避和铜绿假单胞菌的毒力，影响小鼠中的噬菌体治疗DOI：https://doi.org/10.1038/s41564-024-01719-5Lab of rhizosphere Micro-ecologyCompetition & Cooperation
