作者：卢彦如，南京农业大学硕士在读，主要研究土壤线虫与根际健康。
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微生物与宿主之间的相互作用是生物生态系统中的一个重要方面。随着盐藻、线虫等生物模型的研究不断深入，越来越多的证据表明，宿主相关微生物不仅影响宿主的生理功能，还有助于宿主在不同环境下的适应性。然而，在宿主-微生物关系的演化过程中，生物的快速进化与宿主的相对缓慢演化，可能会导致这一关系的动态变化。尽管已有大量研究集中于微生物如何影响宿主功能，但对于微生物如何适应和形成与宿主的专一性互动的机制，仍然知之甚少。
本研究通过实验演化的方法，考察了自由生活的细菌Pseudomonas lurida与模型生物Caenorhabditis elegans之间的相互关系。将二者经历10代演化，进一步探索宿主专一型细菌及其调控方法，为宿主-微生物相互作用进化提供微生物适应机制的新视角。
一、宿主专一型细菌的进化
为了筛选适应宿主的进化细菌，研究人员对6个P.lurida种群进行了系列传代，并分为有无宿主存在的处理组（分别称为EVOhost和EVOctrl）（图1a）。所有种群均来自同一个祖先。在经过10轮宿主传代后，这些细菌在宿主体内的数量平均比其祖先高出5到10倍，这一显著变化在未接触宿主但其它条件相同的对照组中并未观察到（图1b）。细菌适应性的增加并没有对宿主造成负担，因为线虫的种群增长（作为线虫适应度的表现）没有显著变化，反而在适应性细菌的存在下有所增加（图1c）。
通过传代，细菌种群在菌落形态上表现出多样化。在实验结束时，所有宿主相关实验重复群体中，产生了一种“皱褶”的形态，而在对照组中则没有这一形态，同时“模糊”和“光滑”（祖先）形态仍出现在各个处理组中（图1d）。尽管在宿主中表现出显著优势，皱褶形态在琼脂上生长时却有所减少，而光滑和模糊型在丰度上有所增加。由于皱褶形态特有且在适应宿主的细菌中达到极高的丰度，研究人员将其视为宿主专一型。这些专一型细菌可在线虫的肠道内成群出现（图1e）。
为进一步表征这些适应性变化，研究人员重点关注了从演化实验最终种群中分离出的特定、遗传稳定的47个形态克隆。
二、宿主专一型细菌的独特生活方式
对宿主存在不同阶段的性状变化分析，揭示了皱褶形态对与C. elegans相互作用的特定适应性。为此，实验对自由生活阶段的重要性状进行了两项特征的表征，而宿主关联则进行了四项特征的表征（图1a）。研究人员发现皱褶分离株的特征谱与祖先特征谱有显著不同（图1f）。这主要是由于短期持久性、从宿主释放以及体外生物膜形成的显著增加，这些性状都定义了与宿主的后期相互作用。
通过分析来自演化实验结束的遗传多样性种群，研究人员同样观察到宿主关联种群在持久性和释放方面的增加。生物膜形成可以使细菌与宿主保持持久接触，并提高抗压能力，从而提高细菌在线虫的消化道中存活率。由于生物膜形成的增加，聚集的细胞可能更容易被排出，从而解释了观察到的释放增加。这种排放也增加了传播到其他宿主的机会，推动重新启动宿主关联的循环。值得注意的是，皱褶分离株在早期定植中与祖先没有不同，但在平板上的聚集扩展和群游中显示出显著减少（图1f）。此外，研究人员对生物膜形成增加和运动性下降的观察可能表明，在适应宿主关联和自由生活阶段之间的性状存在进化的生活史权衡。
作者总结认为，在宿主线虫的存在下的实验演化导致了宿主专一型的生成和传播。那么，改善宿主关联是否具有共同的遗传基础呢。
图1 进化出一种宿主专一型细菌
研究人员对分离菌株和祖先进行全基因组测序，揭示了在皱褶宿主专一型中存在几个独立的突变，这些突变影响细菌第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）。具体而言，对非沉默基因组变异的比较识别出了特定于皱褶宿主专一型的变异基因（图2a）。wspE和wspF两个基因，分别编码皱褶传播体（wsp）操纵子中的杂合传感器组氨酸激酶和甲酯酶。这些基因是调节c-di-GMP水平的双组分系统的一部分（图2g），参与在β和γ-变形菌及假单胞菌中的皱褶形成。
研究人员发现宿主专一型中独有的突变还存在于编码RNase PH的基因rph中，该基因之前未与c-di-GMP信号传导相关联。使用基于荧光的c-di-GMP传感器和液相色谱-质谱（LC-MS）发现，与祖先相比，三个皱褶分离株中的c-di-GMP水平约增加了两倍，每种分离株均在wspE、wspF或rph中有单一突变（图2b）。这指向wspF的功能丧失突变（其下调c-di-GMP）和WspE及Rph的活性位点的改变，均趋向于上调c-di-GMP。研究人员排列了进化和祖先的氨基酸序列，并确认在WspF功能域的破坏，以及可能阻止WspE去自磷酸化并持续激活下游WspR的接受器域的破坏。Rph外核糖核酸酶域中的氨基酸替代进一步将其核糖核酸酶活性与c-di-GMP代谢联系起来。
由于在其他皱褶变体中观察到类似的c-di-GMP水平增加，而在光滑或模糊突变株中没有观察到，因此接下来研究皱褶特异性突变是否确实导致了改善的宿主关联。对wspE、wspF和rph的功能遗传分析证实了它们在宿主适应中的直接参与。对于该分析，研究人员评估了突变株在宿主定植中相对于祖先的竞争适应度。首先，重新评估了三个选择的皱褶突变株，发现它们的竞争适应度显著高于祖先（图2c），并伴随生物膜形成的增加和体外群游的减少。之后，用对应的祖先等位基因恢复这些突变株，确实消除了突变株的适应度增加。第三，将每个突变引入祖先背景中导致显著更高的竞争适应度，至少对wspF和rph突变株而言。对wspE和wspF突变株在与祖先及其他两个变体进行四方竞争时也观察到了类似的适应度优势。值得注意的是，进化突变株的适应度优势在非本土宿主株（C. elegans实验室株N2）中也被观察到（图2d）。
wspE和wspF两个基因是Wsp系统的组成部分，该系统在其他假单胞菌中调节c-di-GMP水平。理论上，P.lurida菌株MYb11（Pl_MYb11）拥有各类c-di-GMP修饰酶。包括34个编码GGDEF和22个编码EAL结构域的基因，分别具有潜在的二鸟苷酸环化酶（DGC）和c-di-GMP特异性磷酸酯酶（PDE）功能。通过在进化的宿主专一型突变株中使用wspR敲除，验证了Wsp系统中同源DGC在宿主适应中的作用。这一变化消除了突变株在宿主中的竞争优势（图2e），并导致从皱褶到光滑菌落形态的转变，从而将DGC WspR与WspE和WspF（如预期）及Rph（先前未知）联系起来。此外，通过异源表达来源于P. aeruginosa的PDE和DGC直接操控c-di-GMP水平，分别导致在C. elegans中持久性降低或改善（图2f）。因此，可以认为，wspE、wspF和rph的变化通过Wsp系统增加c-di-GMP水平，提高细菌在宿主中的适应性（图2g）。
由于这一第二信使的上调介导了一个基本的生活史转换，因此接下来研究了它是否更普遍地介导了与假单胞菌的宿主关联。
图2 皱纹的宿主专一型细菌通过上调细菌的第二信使c-di-GMP和增加宿主内的竞争力来适应线虫
作者通过观察10代演化的结果，发现Pseudomonas lurida能够发生有益的宿主专一型细菌变异，而这种变异显著提高了其在宿主体内的持久性，并与生物膜的形成密切相关。全基因组测序揭示，细菌第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）的均匀上调突变在这个过程中起到了关键作用。此外，研究还发现这些c-di-GMP上调的突变体在与多种宿主的关联性上得到了一致性增强，这表明c-di-GMP不仅在细菌适应宿主方面扮演核心角色，还可能是多种宿主（包括植物和人类）适应性的重要因素。
总体而言，该研究为我们提供了在讨论宿主-微生物相互作用进化时，理解微生物适应机制的新视角，同时强调了c-di-GMP在这一过程中的重要性。这些发现不仅为进一步探索微生物与宿主之间的动态关系奠定了基础，也为改善微生物相关领域的应用提供了启示。
论文信息
原名：Bacterial c-di-GMP has a key role in establishing host–microbe symbiosis
译名：细菌c-di-GMP在建立宿主-微生物共生关系中起着关键作用
期刊：Nature Microbiology
DOI：10.1038/s41564-023-01468-x
发表时间：2023.8.31
通讯作者：Hinrich Schulenburg
通讯作者单位：基尔大学进化生态学和遗传学系
编辑|卢彦如
排版|贾晓亮
审核|刘婷
南京农业大学-土壤微生物与有机肥料团队
微生态与根际健康实验室
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