作者：卢彦如，南京农业大学硕士在读，主要研究土壤线虫与根际健康。
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Pristionchus pacificus（太平洋线虫）是一种杂食性线虫，具有独特的生命周期，其在环境信号的影响下，在生存和觅食阶段之间转变。全球采样显示，P. pacificus广泛分布，主要与金龟子相关联，并在自然栖息地形成了一个独特的甲虫-微生物生态系统。在这个生态系统中，P. pacificus能够在腐烂的甲虫上生存，从静止的发育阶段（dauer）过渡到主动阶段，以甲虫尸体为食，并在资源枯竭时重新退回到dauer阶段。此外，P. pacificus也是潜在的捕食者，能够捕食腐烂昆虫尸体上的其他线虫，这导致了大量研究探讨与之相关的口器形态可塑性和自我识别机制的调节，及相关的生态和进化意义。这些特征使得P. pacificus成为生态-进化-发育（eco–evo–devo）研究的主要模型。然而，对细菌、线虫和昆虫三方的相互作用的研究仍存在许多局限：首先是线虫觅食导致的细菌演替在甲虫尸体腐烂过程中仅使用16S rDNA方法进行研究，导致对物种身份和功能多样性的解析有限；其次，野外采集的线虫固有的遗传多样性限制了对微生物组对P. pacificus影响的适当理解。因此，目前尚不清楚细菌群落如何随时间变化以及P. pacificus如何响应微生物演替。一、线虫驱动腐败甲虫幼虫的宏基因组变化
研究人员解剖了玫瑰甲虫C. aurata的幼虫，以模拟金龟子自然死亡的过程，并用500只混合阶段的P. pacificus动物对这些无线虫的昆虫尸体进行了接种（图1a）。随后，在接种线虫后的第7天和第21天采样细菌和线虫，分别代表营养丰富和营养有限的条件（分别称为“早期阶段”和“晚期阶段”；图1a）。研究人员观察到早晚阶段微生物群落结构存在重大差异（图1b）。令人惊讶的是，在演替的早期阶段，三种处理的微生物群落结构相似，以Flavobacteriales、Enterobacterales和Burkholderiales种群为主（图1b, c）。相反，在晚期阶段，无线虫对照样本以Burkholderiales为主，而在含有线虫的样本中，细菌物种多样性显著增加（图1b, c）。晚期阶段的群落也与早期阶段的群落大相径庭，以Flavobacteriales、Sphingobacteriales、Hyphomicrobiales和Micrococcales种群为主（图2b）。Pristionchus线虫通过水平基因转移从真核生物供体中获得了纤维素酶基因，并且已经显示这些纤维素酶蛋白被分泌到环境中以消化生物膜。研究人员发现尽管在任何阶段P. pacificus野生型和纤维素酶失活突变体之间微生物群落的结构没有显著差异，但两种线虫株之间的几种细菌物种的相对丰度发生了变化（图2）。因此，该半人工微生态系统清楚地显示出P. pacificus的存在对微生物群落产生了强烈影响。![]()
图1 在幼虫尸体上的宏基因组组装基因组（MAGs）的分类学组成
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图2 在分解的早期和晚期阶段幼虫尸体中宏基因组组装基因组（MAGs）的特征
研究人员通过评估MAG的丰度来监测细菌群落的时间动态。对三个生物重复的平均丰度百分比进行排名，并识别出丰度排名变化的MAG。在早期腐烂阶段，P. pacificus的野生型或纤维素酶失活突变体的存在并未显著改变许多MAG的丰度排名（图2a）。这些MAG可能是P. pacificus线虫不太偏好的或不可消化的细菌。结果表明，在幼虫腐烂的早期阶段，线虫对细菌的消费与细菌丰度并不成比例，某些细菌被高度偏好并选择作为食物。合成钴胺素（维生素B12）或生物素（维生素B6）的能力是这些偏好的MAG的一个独特特征（图2a）。作者分析认为Pristionchus在线虫的细菌消费存在选择性，并且线虫通过以这些偏好微生物为食来获取必需维生素，即核黄素、硫胺素、吡哆醇、烟酰胺、泛酸、生物素、叶酸和钴胺素。这些结果表明P. pacificus能够获取而且可能需要来自自然微生物群落的关键辅因子。无纤维素酶突变体在减少Pseudomonas sp.（75）和Burkholderia sp.（82）的效果上较弱，而这两者是维生素B的主要来源。实验结果表明P. pacificus的纤维素酶可以通过降解生物膜来促进细菌细胞的裂解，而在缺乏线虫纤维素酶的情况下，这些细菌能够在幼虫尸体上繁荣生长。在腐烂的晚期阶段，P. pacificus线虫的存在对细菌结构产生了重大影响，并导致几个主要细菌群体的减少（图1b）。同时，与无线虫处理相比，P. pacificus的存在导致了物种多样性和稀有细菌群体相对丰度的增加（图1c）。当线虫存在时，晚期阶段主导的MAG的基因组大小较小，且与早期阶段的细菌相比（图1d和2b；p < 0.0001）。在含有线虫的两个处理组中，细菌基因组的中值大小（个别细菌物种占丰度的0.5%以上）下降了几乎1Mb（超过总基因组大小的25%）；而在无线虫处理组中，这一数值并未发生变化（图1d，p = 0.50）。这些MAGs的BUSCO分数很高，表明观察到的小基因组大小不太可能是由于错误组装造成的（图2b）。这些MAGs的小基因组中用于辅因子合成途径的基因较少，以及用于防御（例如生物膜和第三型分泌系统）和竞争（例如第六型和第四型分泌系统）的注释基因（图2b），表明它们的主导地位不是由于对线虫捕食的抵抗或物种间细菌竞争，相反，宏基因组组装表明，这种主导地位可能是由于细菌在腐烂的早期和晚期阶段采用不同的生存策略而造成的。已有理论提出，得益于提高的代谢效率和复制能力的基因组较小的生物在资源有限的环境中获得竞争优势，研究人员观察到小基因组细菌占主导地位的现象也支持这一理论。这些发现表明，线虫的存在加速了有机物的耗竭，导致在尸体腐烂晚期主导细菌种类向小基因组细菌的转变。
为了了解自然微生物群落如何在演替的早期和晚期阶段影响线虫生理，研究人员使用了在标准实验室营养源大肠杆菌（E. coli）OP50和腐烂的玫瑰甲虫幼虫尸体上生长的混合阶段P. pacificus的RNA-seq数据进行了基因集富集分析（GSEA）。结果显示，与在OP50细菌培养的琼脂平板上生长的动物相比，生长在幼虫尸体上的野生型动物有多条氨基酸合成和翻译途径被下调（图3a）。在腐烂的晚期阶段，当幼虫尸体上的细菌营养质量下降时，与标准的OP50条件相比，涉及基因组复制、转录和蛋白质合成/降解的途径进一步下调（图3a）。与野生型P. pacificus动物相比，纤维素酶失活突变体的代谢途径基因下调程度更为明显（图3a）。值得注意的是，在早期阶段，纤维素酶失活突变体的能量合成途径被下调，包括柠檬酸循环和氧化磷酸化，而这些现象仅在野生型的晚期阶段被观察到。这些发现可能表明，纤维素酶失活突变体从微生物群落中获取营养的能力降低。幼虫尸体创造了一种环境，对野生型和突变型线虫产生了类似的影响，与在OP50上生长的标准实验室培养相比，导致大规模的基因表达变化（图4）。具体而言，在早期阶段，野生型和纤维素酶失活突变体分别在3643和5886个基因中表现出差异表达。在晚期阶段，这一数字分别增加到10787和11873个基因。图3 复杂的细菌群落改变了Pristionchus pacificus的生理机能
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图4 在不同食物资源下，早期和晚期分解阶段对Pristionchus pacificus野生型的转录组分析
五、微生物群落改变P. pacificus的脂肪代谢
脂滴通常被用作线虫代谢状态的一般指示物。研究人员发现天然微生物群落可以显著影响脂肪分布。在标准实验室条件下，喂食E. coli OP50的P. pacificus成年线虫在肠道和皮下细胞中积累了大量的脂滴，而在幼虫尸体上的P. pacificus通常表现出较低的脂滴水平（图3b）。这一观察结果转录组分析一致，表明在幼虫尸体上脂肪代谢基因表现出差异表达。在腐烂的早期阶段，P. pacificus野生型成年线虫主要在卵母细胞和卵中储存脂滴，而纤维素酶失活突变体的脂滴也出现在肠道（图3b）。此外，纤维素酶失活突变体在腐烂的早期阶段显示出更多的脂肪储存，这表明这些线虫由于觅食效率降低，与微生物群落的互动水平降低。对比而言，在腐烂的晚期阶段，野生型和纤维素酶失活突变体均在肠道中储存脂滴，与在OP50上生长的线虫相比，尾部区域的染色程度较低。结合转录组分析，这些结果表明天然微生物群落可以通过脂肪代谢影响P. pacificus的生理，并改变能量利用策略。
六、缺乏P. pacificus纤维素酶会诱导dauer形成
dauer阶段对线虫生态至关重要，其特点是寿命长、抗逆性强，并且能够进行远距离迁移。在腐烂的晚期阶段，研究人员发现在晚期甲虫幼虫尸体中，dauer幼虫的数量增加，可能与细菌食物的质量和数量下降有关。研究人员观察到在纤维素酶失活突变体中的dauer幼虫比例高于野生型线虫（p = 0.0012，图3c），这种dauer数量的增加是线虫从繁殖阶段转向生存阶段的标志。相应地，在纤维素酶突变体中，雷帕霉素靶标（TOR或mTOR）通路的基因被下调（图3a），该通路已知调节dauer的形成。P. pacificus的纤维素分解能力已被证明能够帮助分解纤维素生物膜并将纤维素转化为简单糖。而在纤维素酶失活突变体处理组中，多个病原物种的丰度增加，这表明纤维素酶可以帮助线虫通过破坏生物膜形成来抑制潜在病原体。因此，食物有限和潜在病原体的增加可能是诱导这些株系形成dauer幼虫的主要因素。这些发现建立在对先前研究的理解上，表明纤维素分解能力可能帮助P. pacificus从天然微生物群落中获取营养，并在昆虫腐烂环境中的生存中发挥关键作用。
所有生物体都具有物种特异性基因，这些基因被认为是最近进化的，可能是对生物体生态位的响应。P. pacificus约有28000个编码蛋白质的基因，但仅有大约三分之一与C. elegans的基因具有一对一的直系同源关系。P. pacificus中约有15000个编码蛋白质的基因在C. elegans中被未发现，使这些物种特异性基因在进化研究中极具吸引力。重要的是，许多P. pacificus特异性基因在标准实验室条件下与任何表型无关，这引发了这些物种特异性基因是否具有真正生物学意义或只是快速进化的DNA序列的问题。因此，研究的结果揭示P. pacificus中的物种特异性基因在幼虫尸体上表现出显著更大的表达倍数变化，与在E. coli OP50对照组下的基因相比（图4a，p < 0.0001）。在物种特异性基因和一对一直系同源基因中，下调的基因数量超过上调的基因数量。在P. pacificus中，一些物种特异性基因家族在进化过程中经历了扩展，包括类表面活性蛋白、水平获得的纤维素酶和休眠蛋白（图4b）。这些基因主要参与细菌的相互作用，单个基因拷贝倍数变化差异表明基因复制后功能多样化。例如，在八个注释的Diapausin基因中，有五个在标准实验室条件下的表达值接近于0，而在幼虫尸体上生长时，其表达增加了约4到8200倍。这些结果表明，在不同的调控网络中，这些基因的表达在不同的环境下发生了变化。综合来看，这些发现为使用分解的甲虫幼虫模拟微生物生态系统并应用宏基因组测序以捕捉不同腐烂阶段微生物群落的功能动态提供了新的视角。本研究探讨了微生物群落的演替如何影响线虫（Pristionchus pacificus）的生理特征，特别是在腐烂的甲虫幼虫微生态系统中。研究通过建立实验室微生态系统，模拟甲虫幼虫的自然微生物环境，以观察线虫与其微生物群落之间的相互作用。结果显示，线虫的存在显著改变了微生物群落的组成，尤其是在腐烂过程的早期和晚期阶段。早期阶段，线虫对富含维生素B合成基因的细菌表现出偏好，而在晚期阶段，随着营养物质的减少，线虫的食物选择转向基因组较小的细菌，这些细菌在资源有限的环境中具有更强的生存优势。此外，研究还发现线虫的生理状态受到微生物群落的影响。在早期阶段，线虫的脂肪代谢和生殖能力受到促进，而在晚期阶段，营养质量下降导致线虫转向生存阶段，表现出更多的dauer（休眠）形态。通过转录组分析，研究揭示了线虫在不同微生物环境下的基因表达变化，特别是与脂肪代谢和应激反应相关的基因。本研究首次系统性地描述了Pristionchus线虫与其自然微生物群落之间的相互作用，强调了微生物群落演替在生态系统中的重要性，并为理解线虫的生理适应提供了新的视角。这些发现不仅丰富了我们对线虫生态学的理解，也为未来的微生物与宿主相互作用研究奠定了基础。
论文信息
原名：Microbiota succession influences nematode physiology in a beetle microcosm ecosystem
译名：微生物群落演替影响甲虫微生态系统中的线虫生理
期刊：Nature Communications
DOI：10.5281/zenodo.10875885
发表时间：2024.6.15
通讯作者：Ralf J. Sommer，韩自端
通讯作者单位：德国马克斯·普朗克生物学研究所综合进化生物学系；西北农林科技大学植物保护学院作物抗逆性和高效生产国家重点实验室
南京农业大学-土壤微生物与有机肥料团队
微生态与根际健康实验室
Lab of rhizosphere Micro-ecology
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