JACS | 陆晓杰/许叶春团队利用共价DNA编码化合物库工作流实现对新冠非结构蛋白抑制剂的高效筛选

学术 2024-12-01 14:30 四川

新型冠状病毒SARS-CoV-2非结构蛋白（Non-structural proteins, Nsps）是由病毒基因组的开放阅读框ORF1a（Open Reading Frame 1a）和ORF1b（Open Reading Frame 1b）编码的多聚蛋白经裂解而产生的功能性蛋白。这些蛋白并不直接构成病毒颗粒，但在病毒复制和感染过程中发挥关键作用。它们通过与宿主细胞和其他病毒因子相互作用，调控病毒的生命周期和逃避宿主免疫系统。其中Nsp3（PL^pro，木瓜蛋白酶样蛋白酶），Nsp5（3CL^pro，主蛋白酶）以及Nsp7/8/12复合物作为关键的非结构蛋白，其在参与病毒转录和翻译过程发挥重要作用，因此成为研究最为广泛的病毒治疗靶点。Nsp3和Nsp5作为蛋白水解酶，其蛋白结构中的催化二联体/催化三联体用于催化底物断键水解；由Nsp7/8辅助因子联合形成的Nsp12复合物其结构中同样富含有大量半胱氨酸残基，因此上述三个靶点是理想的共价抑制剂作用靶标。然而目前针对Nsp3的共价抑制剂鲜有报道，针对Nsp5的共价抑制剂主要集中在拟肽类骨架，而针对Nsp7/8/12复合物，更是尚未有明确证明与之共价的抑制剂研究。

近日，中国科学院上海药物研究所陆晓杰团队联合许叶春团队在Journal of the American Chemical Society上发表了题为 Covalent DNA-Encoded Library Workflow Drives Discovery of SARS-CoV-2 Non-structural Protein Inhibitors 的研究型论文。该研究开发了共价DNA编码化合物库工作流技术，实现对新冠病毒中上述富含半胱氨酸的系列非结构蛋白的共价筛选，并应用该方法鉴定出具有新颖骨架的共价苗头化合物，并首次揭示了Nsp3的共价变构结合位点。

在本研究中，针对SARS-CoV-2 PL^pro蛋白，研究者通过将野生型和催化残基C111S突变的蛋白进行对比筛选，从而选择性地鉴定出与催化位点相结合的共价抑制剂；随后，通过合成On-DNA化合物凝胶电泳分析和晶体学手段进一步验证了所得苗头化合物与靶标半胱氨酸反应位点和结合模式。小分子-蛋白配体复合物的共晶结构表明苗头化合物共价结合在泛素口袋之外的浅表面结合位点，并阐明苗头化合物发挥功能的关键氢键相互作用，并通过相似库的对比，构建标准化的富集度，从而实现对不同共价linker反应性的预测；针对SARS-CoV-2 3CL^pro靶点，由于筛选过程DEL库中的分子均带有一段核酸链，而hit分子与核酸连接的位置暴露在溶剂区域，因此研究人员前期通过共价对接手段，通过引入构象限制，从而实现精准的对接分析，后续的蛋白-配体复合物晶体结构进一步证明该方法的适用性。

On-DNA 化合物的SDS-PAGE共价验证方法

最后，研究团队针对Nsp7/8/12同样进行凝胶电泳分析，证明hit分子对复合物选择性的共价结合蛋白，并通过QM/MM模拟揭示了潜在共价结合位点；随后在分子优化过程，研究者对DEL筛选结果进行片段化的构效关系分析，结合DEL常用的分子优化策略，成功得到活性在百纳摩尔的先导化合物。

上海药物所陆晓杰研究员、许叶春课题组胡杭晨副研究员、中科苏州药物研究院梅良和博士为本文共同通讯作者。上海药物所博士研究生王旭东、杭州高等研究院硕士研究生熊丽伟、南京中医药大学联合培养硕士朱英和上海药物所博士研究生刘思秀为本文共同第一作者。

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c12992

制版人：十一

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