虎杖皂苷通过SASP下调延细胞衰老,并通过激活sir-2.1/自噬延长秀丽隐杆线虫的健康寿命

文摘   科学   2024-05-15 20:51   陕西  

《Industrial Crops & Products影响因子:5.9/Q1


《Industrial Crops & Products》发表关于具有工业价值(非食品、非饲料)的栽培植物(作物)的研究。论文涉及作物导向和生物基材料研究。它应该引起国际观众的兴趣,假设驱动且可重复。感兴趣的作物和产品包括:纤维、森林和能源作物、工业油籽、橡胶和树脂,以及栽培的药用和芳香植物。


虎杖被广泛认为是抗衰老的潜在资源。本研究旨在基于目前有前途的抗衰老靶点,探讨植物主要活性成分皂苷的具体作用和作用机制。结果表明,虎杖皂苷(PKS)显著延缓了应激诱导和复制的细胞衰老。用 PKS 处理的模型细胞 MRC-5 表现出增加的细胞增殖活力、降低β半乳糖苷酶活性和改善的细胞周期停滞。这些积极的趋势归因于PKS对衰老相关分泌表型(SASP)的下调。在PKS作用下,IL-6、IL-8、CXCL-10等典型SASP因子的mRNA表达和因子分泌水平显著降低,有效抑制了SASP介导的衰老扩散,改善了细胞微环境。此外,PKS被发现对模型动物的健康寿命有有利的影响。用PKS处理的秀丽隐杆线虫(秀丽隐杆线虫)寿命延长,脂褐素积累显著减少,抗逆能力增强,抗氧化活性增强(SOD/CAT/MDA/ROS)。进一步的机制研究表明,PKS可以上调秀丽隐杆线虫中的sir-2.1 ,进而影响daf-16的转录活性。此外,PKS表现出自噬诱导作用,自噬相关基因(lgg-1和bec-1)的表达上调以及用PKS治疗的蠕虫中监测的自噬体数量的增加证明了这一点。这些发现表明,PKS具有多种抗衰老途径的优越性。PKS作为一种很有前途的抗衰老天然药物资源,值得进一步应用和发展。

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 PKS提取物中皂苷成分的鉴定



PKS中皂苷成分的分析结果表明,PKS提取物以甾烷皂苷为主,包括呋喃甾烷醇皂苷(金香皂苷C/D、Pratioside B等)和螺甾烷醇皂苷(薯片星、金香皂苷A/B等)。此外,少量三萜皂苷(积雪草苷、人参皂苷 Rb1)也被检测到。据报道,螺甾烷醇皂苷几乎存在于每种虎杖植物中,然而,不同物种的糖苷元类型各不相同;发现龙胆素和黄皂苷元是虎杖中的主要苷配元。我们鉴定了相应的代表性物质,如金香糖苷A/B、(25 R)-金参皂苷G、Pratioside D1PKS提取物中的(gentrogenin)和funkioside C(pennogenin)。而虎杖中的特异性苷元为黄靖苷元,代表性物质为黄苷苷元、黄苷苷C/D/E等,在我们的样品中确实没有鉴定出来。这与先前研究的结果一致。


PKS对MRC-5细胞应激诱导和复制衰老水平的影响

细胞衰老是增殖细胞脱离细胞周期并进入永久性生长停滞状态的状态。衰老细胞的显着特征包括增殖能力降低,衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性增加,细胞周期停滞。本研究以体外42-46代增殖极限为特征的MRC-5细胞建立细胞衰老模型。通过增殖活力、β半乳糖苷酶活性和细胞周期指标评估PKS对复制性衰老(自然衰老)和应激诱导衰老(过早衰老)的影响。

应激诱导衰老模型结果显示,与对照组相比,模型组细胞存活率显著降低,增殖速度减慢。用PKS预处理的细胞在暴露于压力时可以有效地维持增殖活力。与模型组相比,H(0.50 mg/mL)和M(0.10 mg/mL)剂量组的细胞存活率有所提高,差异有统计学意义(P < 0.01,P < 0.05)。复制衰老模型的结果也表明,PKS可以改善细胞衰老水平,与对照组相比,样品组的细胞表现出显著的增殖活力增加,而M(0.10 mg/mL)剂量组显示出最好的效果,细胞活力相对增加30.14%, 但在低剂量组中未见显著效果。
SA-β-Gal可水解底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖-吡喃糖苷)化合物,生成蓝色不溶性物质。染色率越高,细胞衰老水平越高。如图,当MRC-5细胞受到D-gal刺激时,模型组的蓝色染色率达到50.13±5.92%;与正常对照组相比,它显着增加,表明β半乳糖苷酶活性增加和细胞衰老显着增加,表明建模成功。
流式细胞术检测结果显示,两种衰老模型的细胞周期分布趋势相似。胁迫诱导模型组在G0/G1期受阻,与对照组相比,该期细胞占比上升56.78%,差异有统计学意义;复制衰老对照组64.8%的细胞大量停滞在G0/G1期,提示细胞衰老程度增加。在两种模型中,PKS预处理的样品组G0/G1期细胞比例均显著降低,增殖S期细胞均呈增加趋势,特别是应激诱导老化样品组的增强达到显著水平,提示衰老水平得到有效缓解。
这些结果表明,PKS对细胞衰老水平的改善有积极贡献,这种作用涉及压力诱导的衰老和复制性衰老。
PKS对MRC-5细胞SASP因子的影响

SASP是一系列细胞因子的总称,包括促炎因子(IL-6,IL-8),基质金属蛋白酶(MMPs),趋化因子(CXCL-1,CXCL-10),生长因子(HGF,TGF-β)等。SASP不仅是衰老细胞的关键特征,也是促进衰老和诱发各种衰老相关疾病的因素。研究人员检查了两种衰老模型中一些具有代表性的SASP因子的mRNA表达水平。结果显示,应激诱导后,模型组所有测试SASP因子的mRNA表达水平均较对照组升高,IL-6、IL-8、MMP-3、CXCL-10与对照组的差异均达到显著水平。相比之下,与模型组相比,用 PKS 预处理的细胞的 IL-6、IL-8 和 CXCL-10 分别相对降低了 25.71%、37.59% 和 35.06%。显示复制衰老也受到PKS的影响。与衰老对照组相比,样本组IL-6、IL-8、CXCL-10和HGF的mRNA表达水平显著降低,但MMP3和TGF-β1未观察到显著变化。

进一步验证了SASP因子IL-6、IL-8、CXCL-10等的体外分泌水平,mRNA在衰老模型中显著变化。如图所示,与应激诱导模型组相比,样品组的IL-6、IL-8和CXCL-10因子分泌水平显著降低。样品组IL-6、IL-8、CXCL-10和HGF因子的分泌水平也显著低于衰老对照组。这些实验结果表明,PKS在下调SASP方面具有积极作用。


PKS对秀丽隐杆线虫寿命和脂褐素积累的影响

寿命是评估抗衰老活性的最直接指标。本研究以生命周期短的秀丽隐杆线虫为模式生物,评价PKS体内抗衰老活性。如图所示,N的平均寿命为N2对照组蠕虫数量为20.37±1.06 d,不同剂量组PKS中蠕虫的平均寿命均延长;更具体地说,效果最佳体现在0.125 mg/mL浓度组,平均寿命达到23.20±0.88天,与对照组相比增加了13.89%。由于0.125 mg/mL的样品浓度将蠕虫的寿命延长到最显着的水平,因此它用于干预PKS样品组中所有后续测试指标的蠕虫。

脂褐素作为一种衰老色素,会随着衰老的进行而在蠕虫体内积累,衰老程度越高,脂褐素的积累水平就越高。从荧光显微镜照片可以看出,对照组在15 d时荧光强度较强,表明该阶段蠕虫衰老水平显著,体内脂褐素积累水平高。然而,一直以来,PKS的参与显著改善了蠕虫的衰老过程,样品组的脂褐素积累水平比对照组降低了49.79%。


PKS对秀丽隐杆线虫抗逆性的影响

抗氧化能力等抗逆能力与寿命延长密切相关,并已被证明是预防各种衰老相关疾病的关键因素之一。增强抗压能力是保持健康寿命的有效方法之一。本研究通过体内耐热/抗氧化应激、抗氧化能力(SOD/CAT/MDA/ROS)来评估PKS对蠕虫抗逆性的影响。从图中可以看出,在37 °C下热刺激蠕虫12 h时,对照组的存活率仅为22.92±5.98%,而喂食PKS的蠕虫的存活率显著更高(60.53±11.61%)。此外,与对照组(31.15 ± 8.49%)相比,当蠕虫暴露于百草枯刺激诱导的氧化应激时,PKS 干预组的存活率提高了 75.85%。

此外,还发现PKS可以增加体内蠕虫的抗氧化活性。图6B结果显示,样品组抗氧化酶SOD和CAT的活性分别是对照组高1.09倍和1.54倍;与对照组相比,样品组蠕虫体内脂质过氧化物(MDA)的积累量降低了37.69%,差异显著(P < 0.05)。ROS测试结果显示,当蠕虫生长到15 d时,对照组积累的ROS水平处于较高水平,荧光强度较强,如图所示。相比之下,喂食PKS的蠕虫的ROS水平比对照组相对降低了60.23%,如图所示。这表明PKS在调节ROS方面具有作用。综合指标表明,PKS可以有效增强蠕虫的抗逆性,对维持健康寿命产生有利影响。


SIR-2.1和DAF-16对于延长秀丽隐杆线虫寿命的PKS至关重要

实验结果表明,daf-16是PKS延长蠕虫寿命的关键参与者,在PKS作用下,daf-16转录活性增强。此外,本实验还研究了daf-16、sod-3和hsp16.2的下游靶基因。sod-3在一定程度上被激活,mRNA水平比对照组高1.10倍,而hsp-16.2没有显著变化。由于靶基因的选择性激活与daf-16与其不同辅因子之间的相互作用有关;它还受到复杂的下游调控机制的影响。因此,需要纳入更多潜在相关的靶基因进行进一步研究。
已发现饮食限制可以延长生物体的寿命。因此,PKS延长蠕虫寿命是否与饮食限制的影响有关是值得关注的。eat-2突变体(DA1116),通常用作模拟饮食限制的影响,应用于本研究。图 中显示,PKS干预后eat-2突变体的寿命相对延长了10.72%,与对照组差异显著(P < 0.05),表明PKS对秀丽隐杆线虫的影响与饮食限制途径无关。

PKS延长秀丽隐杆线虫的寿命与自噬诱导有关

qPCR结果显示,PKS作用下蠕虫lgg-1和bec-1的mRNA水平分别比对照组高1.32和1.15倍,差异有统计学意义(P <0.05)。它表明PKS可以通过激活蠕虫中的自噬途径来延长寿命。Bec-1缺陷蠕虫(VC424)寿命实验结果显示,突变体与PKS干预下的对照组差异无统计学意义(P>0.05),表明PKS依赖bec-1延长蠕虫寿命。同时,我们使用融合表达LGG-1::GFP的突变蠕虫来监测自噬体的形成。随着PKS的干预,蠕虫中LGG-1::GFP斑点的数量显著增加,表明自噬水平增强。这些结果表明,PKS对自噬具有积极的调节作用,因此可能影响蠕虫的寿命。






虎杖皂苷可以显著延缓MRC-5细胞中应激诱导和复制的衰老。细胞衰老水平的降低可能与PKS下调SASP因子水平的能力有关,有利于改善细胞微环境。在体内,PKS可以延长秀丽隐杆线虫的寿命,并显著减少蠕虫体内脂褐素的积累。在PKS的干预下,蠕虫的抗逆性也得到增强,表现出对热应激和氧化应激的耐受性增强,抗氧化酶(SOD/CAT)活性增强,脂质过氧化(MDA)减少,体内ROS积累减少。我们推测PKS对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用可能与sir-2.1的上调和daf-16转录活性的增强有关。此外,PKS的干预导致蠕虫自噬活性增加,这也可能是秀丽隐杆线虫健康寿命增加的原因之一。本研究的新视角揭示了PKS在抗衰老方面的优越性,因为它通过多种途径起作用。鉴于PKS还具有出色的血糖和血脂调节作用,有利于预防和治疗与年龄有关的疾病。因此,PKS作为一种潜在的抗衰老活性物质,值得深入探索和开发。



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