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《Journal of Biomedical Science》影响因子：9.0/Q1(一区）
《Journal of Biomedical Science》
《生物医学科学杂志》是一本开放获取、同行评审的期刊，涵盖了基础医学科学的所有基础和分子方面，强调提供生物医学问题和分子机制的分子研究。
角质细胞是皮肤最外层表皮中的主要细胞类型。在人类中，角质细胞约占表皮细胞的90%，在皮肤老化中起着至关重要的作用。有趣的是，衰老的角质细胞能够产生SASP因子；其中包括细胞因子、细胞外基质重塑酶和各种其他分子，它们对其他细胞产生长期影响，从而加剧衰老过程。此外，在皮肤老化过程中，可以在角质细胞中观察到线粒体损伤增加和活性氧(ROS)水平升高。因此，保持线粒体的完整性和减少氧化应激是减缓皮肤衰老的潜在策略。以前的研究已经揭示了橙皮素，一种在柑橘类水果皮中发现的黄烷酮苷元，发挥了几种有益的特性；这些作用包括作为抗氧化剂和抗炎剂，以及提供细胞保护。以上都有助于皮肤健康。研究表明，橙皮素是一种潜在的皮肤抗衰老方案。然而，橙皮素抗衰老作用的分子机制还不完全清楚。此外，橙皮素对表皮角质细胞衰老的影响仍未被研究。小鼠遗传研究表明，在衰老过程中保持高水平的CISD2能够维持Ca2+体内平衡，平衡氧化还原，并保护线粒体功能，从而延缓皮肤衰老。
我们已经确定橙皮素是一种有效的CISD2激活剂，能够显著增强老年小鼠心脏和骨骼肌中CISD2的表达，从而促进健康长寿，同时在长期治疗(6-7个月)后没有检测到体内毒性。在这里，我们研究橙皮苷治疗老化皮肤的生物学效应，首先使用细胞平台，即从老年人建立的HEK001人角质细胞系，其次使用小鼠模型，即21个月大的老年小鼠。具体而言，我们研究了橙皮素对uvb诱导的光老化和自然老化皮肤的抗衰老作用，并确定了潜在的机制和可能的生物学途径。
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CISD2主要表达于表皮基底层的增殖性角质形成细胞中，在人皮肤表皮暴露于阳光下的部位表达下调![]()
研究人员发现CISD2主要表达于表皮基底层的增殖性角质形成细胞中，而CISD2蛋白在棘层角质形成细胞中的表达显著降低，在颗粒层角质形成细胞中消失(图A)。此外，与通常不受阳光照射的胸部、肱骨背部、肛门和大腿的皮肤组织样本相比，暴露在阳光下的皮肤，即面部和颈部，CISD2蛋白的表达水平显著降低(图B-D)。有趣的是，在人皮肤角质形成细胞中，CISD2蛋白的表达水平与KRT14蛋白的表达水平呈正相关(图E)。先前的研究表明，CISD2缺乏会损害角膜上皮细胞和癌细胞系的细胞增殖。此外，KRT14缺失也会在KRT14敲低的HaCaT人角质形成细胞中降低细胞增殖并延缓细胞周期进展。因此，CISD2可能参与基底角质形成细胞的增殖。此外，根据从Human Protein Atlas数据库(https://www.proteinatlas.org)获得的信息，CISD2也在表皮角质形成细胞、朗格汉斯细胞和黑素细胞中表达，但在真皮成纤维细胞中未检测到这种表达。值得注意的是，与通常受到良好防晒保护的耻骨上皮肤相比，更容易接触阳光的小腿皮肤中的CISD2 mRNA水平明显较低(图F)。这些结果表明，CISD2主要表达于表皮基底层增殖性角质形成细胞中，阳光照射可能下调CISD2的表达。橙皮素通过增强老年人HEK001人角质形成细胞中CISD2的表达，改善线粒体功能并降低氧化应激![]()
结果表明CISD2在角质形成细胞衰老过程中下调(图A)。之前我们已经发现橙皮素是一种有效的Cisd2激活剂。值得注意的是，当HEK001角质形成细胞用橙皮素 (10 μM)处理48小时后，CISD2表达水平显著增加约两倍(图B)。不同浓度橙皮素(1、3、10、30和100 μM)对细胞增殖无明显影响;此外，当浓度低于30 μM时，没有细胞毒性作用。为了研究橙皮素是否能够增强HEK001角质形成细胞的线粒体功能，我们测量了橙皮素治疗后的线粒体OCR。值得注意的是，橙皮素增加了线粒体OCR，包括基础呼吸和atp偶联呼吸(图C)。此外，为了研究橙皮素是否以CISD2依赖的方式发挥作用，我们在治疗前进行了CISD2 KD (shCISD2)(图D)。有趣的是，与HEK001-shLuc对照细胞相比，HEK001-shCISD2细胞的基础呼吸和atp偶联呼吸均显著降低。重要的是，橙皮素在HEK001-shCISD2细胞中失去了增强线粒体OCR的有益作用(图E)。这一结果表明，CISD2在线粒体功能中起着至关重要的作用，橙皮素的有益作用依赖于HEK001角质形成细胞中CISD2表达的机制。研究人员测量了HEK001-shCISD2和HEK001-shLuc细胞在H2O2刺激下的ROS水平。发现橙皮素能够在没有H2O2刺激的情况下降低ROS的基础水平，在H2O2刺激下也会发生这种情况。然而，这些抗氧化作用在HEK001-shCISD2细胞中消失(图F)。研究结果显示橙皮素显著减缓H2O2诱导的HEK001-shLuc细胞线粒体膜电位下降。然而，橙皮素在HEK001-shCISD2细胞中未观察到明显的抗氧化作用(图G)。综上所述，这些结果表明橙皮素通过上调CISD2表达增强HEK001人角质形成细胞的线粒体功能并保护其免受氧化应激，并且主要以CISD2依赖的方式起作用。为了研究橙皮素对UVB诱导的老年人角质形成细胞损伤的保护作用，我们在将HEK001细胞暴露于UVB辐射前用橙皮素预处理2天。在UVB辐射处理后24 h和48 h收集条件培养基(图H)。橙皮素在没有辐射的基础条件下和UVB辐射后都下调了HEK001角质形成细胞中细胞内MMP-1的水平(图I)。此外，橙皮素处理也降低了条件培养基中免疫分析法检测到的前mmp -1水平(图J)。这些结果表明橙皮素能够减轻UV诱导的HEK001角质形成细胞的损伤。
橙皮素通过增加CISD2表达改善UVB诱导的小鼠皮肤光老化
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为了评价橙皮素对UVB诱导的皮肤光老化的影响，我们用橙皮素(10 mg/kg/d，腹腔注射)预处理小鼠7 d，然后暴露于UVB;放疗结束2天后采集皮肤组织样本(图A)。值得注意的是，在UVB损伤后的皮肤样本中，发现CISD2蛋白水平显著下降了50%。值得注意的是，橙皮素处理不仅减弱了uv诱导的CISD2下调，而且与对照皮肤样品相比，CISD2蛋白水平显著提高了约2.6倍(图B)。UVB照射后，野生型(WT)小鼠背部皮肤样品明显发红，皮肤表面有较厚的皱纹。相比之下，橙皮素保护皮肤免受这些明显表型变化的影响，正如橙皮素处理小鼠皮肤光滑无皱纹所示。此外，组织病理学分析还显示，UVB照射导致皮肤厚度显著增加，包括表皮和真皮层。相比之下，橙皮苷处理显著降低了UVB损伤后皮肤的增厚(图C和D)。此外，UVB处理导致小鼠皮肤样品中ROS和RNS水平以及细胞内MMP-1蛋白水平显著升高。另一方面，橙皮素显著减弱了这些uvb引起的皮肤损伤指标(图E和F)。为了描述橙皮素的有益作用是否以cisd2依赖的方式与UVB诱导的损伤功能有关，我们对Cisd2KO小鼠进行了UVB辐射实验(图3A)。值得注意的是，在Cisd2KO小鼠中，橙皮素在保护uvb诱导的皮肤损伤方面失去了有益的作用，在橙皮素处理后，通过皮肤表面残留的红色来评估背部皮肤的总体视图，以及在皮肤厚度、表皮和真皮层厚度方面(图C和D)。接下来，我们评估了各种不同给药途径的有效性。结果显示，在UBV诱导的皮肤损伤保护方面，口服橙皮素与腹腔注射橙皮素一样有效。总之，这些结果表明橙皮素能够改善UVB诱导的皮肤损伤，并表明橙皮素主要以依赖于CISD2表达的方式起作用。具体来说，由于CISD2的缺失，橙皮素在Cisd2KO小鼠中失去了它的有益作用。![]()
有趣的是，外用橙皮素(10 μM)处理能够增强CISD2报告基因小鼠耳皮肤中的CISD2报告基因表达。此外，与幼龄小鼠(3个月大)相比，中年小鼠(14个月大)和老年小鼠(24个月大)皮肤中的CISD2蛋白水平显著降低。这与我们之前的研究结果一致，即在衰老过程中，多种组织中CISD2表达的年龄依赖性下降。此外，橙皮素处理(10 mg/kg/天，连续30天)显著增加了中年WT小鼠(4个月大)皮肤中的CISD2蛋白水平。
为了研究橙皮素是否能够延缓甚至恢复自然老化的皮肤，我们用橙皮素(100 mg/kg/天的食物中提供)治疗老年小鼠(21个月大)5个月，并在26个月大时处死(图A)。研究发现，与26个月大的小鼠相比，这些小鼠皮肤中的CISD2水平明显降低。然而，研究发现，饮食中的橙皮苷可以增加老年小鼠皮肤样本中的CISD2蛋白水平，达到与3个月大的年轻小鼠相当的水平(图B)。这一结果表明，在生命的后期，皮肤中的CISD2水平可以通过饮食橙皮素进行药物靶向。在自然衰老过程中，26个月大的小鼠皮肤中可以检测到多种组织病理学表型;包括皮肤厚度减少、皮下脂肪减少、脱发和皮脂腺萎缩(图C)。引人注目的是，橙皮素治疗减轻了所有这些与年龄相关的有害变化，包括增加毛囊密度(图D)，增加皮脂腺的大小和增加每个皮脂腺的核数(图E和F)。此外，已知ROS水平的增加是促进皮肤衰老的主要因素之一。值得注意的是，橙皮素处理后，老龄小鼠皮肤中ROS和RNS水平均显著降低(图G)。总之，这些结果表明，在老年小鼠自然老化的皮肤中，用膳食橙皮素进行晚年治疗能够增强CISD2的表达。由于CISD2表达的增强，年龄相关的皮肤表型得到了很大的改善，甚至在一定程度上在组织病理学方面恢复了活力。
为了探索橙皮素有益作用的分子机制，我们对接受和未接受橙皮素治疗48小时的老年人HEK001人角质形成细胞进行了RNA测序(RNA-seq)和通路分析，并对12103个基因的mRNA水平进行了量化。RNA-seq分析显示，橙皮素增强了CISD2 mRNA和KRT14 mRNA的水平(图A)。这与研究结果一致，在人类皮肤中，角质形成细胞中CISD2和KRT14蛋白水平呈正相关。主成分分析显示，载体处理的角质形成细胞和橙皮素处理的角质形成细胞在转录组谱上存在显著差异(图B)。接下来进行成对DEG分析，具体来说，使用DESeq2(与Wald检验)获得归一化计数和DEG。在此分析中，总体FDR被控制在0.005以下，绝对基因表达倍数变化>1.5 (Hes vs. Veh，上调或下调)。在hesperetin的影响下，共有1723个deg上调821个，下调902个(图C)。使用GO和KEGG通路分析对deg进行注释。氧化石墨烯分类(生物过程)的功能富集分析显示，氧化石墨烯与代谢、蛋白质平衡、细胞周期、细胞死亡和衰老、应激反应、炎症和免疫反应、角质细胞功能和氧化还原稳态相关(图D)。此外，GO和KEGG通路富集分析表明，deg参与了许多重要的信号通路，包括WNT、Hippo、AGE-RAGE、MAPK、JAK-STAT和p53，以及细胞周期、铁死亡、细胞衰老和炎症相关的信号传导(图E)。值得注意的是，橙皮素处理后，角质形成细胞SASP相关的11个因子显著下调(图F)。deg的IPA鉴定出了几个重要的途径(p < 0.05，绝对Z评分> 1)。这些形成了四个主要的功能组:(1)信号通路，(2)应激反应，(3)蛋白酶抑制，(4)细胞周期，细胞死亡和免疫应答(图G)。有趣的是，与应激条件下的寿命调节和细胞稳态维持相关的ATM和PTEN信号通路被hesperetin显著激活。相反，几种与衰老或衰老相关的信号通路，包括HIF1α、ID1、HOTAIR、ERK/MAPK和mTOR，被橙皮素显著抑制(图5G)。这些转录组学结果表明橙皮苷能够减缓细胞衰老并调节氧化还原稳态，其中包括对氧化应激的反应、ROS代谢的调节以及氧化还原(图D)。此外，转录组学研究结果也与橙皮素处理的HEK001角质形成细胞在提高抗氧化能力和促进线粒体功能方面的表型研究结果一致。橙皮素激活与长寿相关的调节因子，抑制与衰老相关的分泌表型
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FOXM1和FOXO3a这两个参与延缓衰老和促进长寿的转录因子被发现被显著激活(图A）。此外，FOXO3a被认为可以激活多种参与细胞增殖、细胞存活和DNA修复的基因(图A)。同样，FOXM1有几个下游靶基因，如AURKB、BIRC5、BUB1B、PLK4和CDK1，这些基因也上调。另一方面，两个免疫应答相关基因IKBKB和NFKB2被发现下调。橙皮素无法诱导FOXM1的两个下游靶基因BUB1B和PLK4在FOXM1 KD角质形成细胞中的表达，这表明橙皮素处理下FOXM1是这些基因的上游调节因子。橙皮素下调了FOXO3a的几个抑制因子。值得注意的是，橙皮素显著提高了线粒体转录和基因组维持所必需的TFAM(线粒体转录因子A)和线粒体转录辅助因子TFB1M(线粒体转录因子B1)(图B)。橙皮苷处理后，构成复合体I、III、IV和V的一组核编码基因显著增加(图C)。与上述相反，与免疫应答和SASP相关的白细胞介素-1α (interleukin-1α， IL1α)及其下游基因[55]被橙皮素显著下调。
这些发现表明橙皮素具有抗炎和抗衰老的双重作用。事实上，IL-1α下游靶基因之一MMP-1是一种紫外线损伤标志物，与此相关，我们已经证明，在UVB辐射下，橙皮素下调了MMP-1的蛋白水平(图I)。此外，橙皮素治疗显著增强了几种免疫反应和炎症相关通路，包括TNF信号、IKK/NF-κB信号、细胞对TGF-β刺激的反应和IL-17信号(图E)。提示橙皮素的抗炎作用可能是通过调节多种促炎因子和信号来实现的。总之，我们的转录组学和通路分析表明，橙皮苷可能通过抑制其上游抑制信号来激活FOXO3a活性。这随后通过部分抑制IL-1α信号传导以及通过增强CISD2表达来减弱SASP因子的表达。这些变化发挥了有益的作用，线粒体功能增强，氧化应激减少，对uvb引起的损伤的反应能力增强。这些作用抑制了从老年男性个体获得的HEK001角质形成细胞的衰老(图D)。
在这里，我们提供了证据并证明了CISD2蛋白水平在晚年阶段的药理学升高是可行的，并且这种增加可以减轻皮肤的内在衰老(即通过时间本身的衰老)和皮肤的外在衰老(例如由阳光和紫外线辐射引起的衰老)。橙皮素是我们测试的第一种化合物，作为对CISD2激活剂对皮肤具有抗衰老作用的假设的概念验证。因此，开始开发橙皮素作为功能性食品或作为局部治疗的护肤产品是非常有趣的，目的是通过增强CISD2表达和激活各种衰老保护转录因子，如FOXO3a和FOXM1，来减缓和/或恢复衰老的皮肤，这些转录因子被认为可以调节各种其他与长寿相关的信号通路。
