棕色脂肪来源的细胞外囊泡可通过NPM3诱导白色脂肪褐变并有效对抗肥胖

文摘 2024-10-30 15:44 陕西

题目：Nucleophosmin3 carried by small extracellular vesicles contribute to white adipose tissue browning

通讯作者：田卫东；

单位：四川大学华西口腔医学院；

文献来源：Journal of nanobiotechnology；2022；

《Journal of Nanobiotechnology》（JCR:Q1，IF：10.6）是一份开放获取的同行评审期刊，交流医学和生物学领域的科学和技术进展，重点是其与纳米尺度科学的界面。该期刊为生物医学科学家和国际生物技术商业界提供新兴纳米生物技术领域的最新发展。该期刊包括：生物学、医学、食品、环境和农业中的纳米材料-生物学、医学、食品和环境中的纳米粒子-生物学、医学、食品和环境中的纳米传感器-纳米医学：诊断、成像、治疗和药物开发-微纳米流体学；微纳米机电系统（MEMS & NEMS）-纳米毒理学。

导读

脂肪组织通常分为三种类型，包括白色脂肪组织（WAT）、棕色脂肪组织（BAT）和米色脂肪组织。WAT储存能量并在禁食期间提供能量以维持能量稳态。与WAT相比，BAT是一种产热组织，通过消耗葡萄糖和脂肪酸来消耗能量。棕色脂肪细胞与白色脂肪细胞不同，白色脂肪细胞具有多房脂滴结构，细胞质中有大量的线粒体。事实上，BAT是主要的脂质清除器官，在寒冷暴露下具有最高的脂肪酸氧化率。因此，BAT激活可能是治疗肥胖和肥胖诱发疾病的新方法。最近，几项研究表明，激活或移植BAT可以促进热量消耗、减少肥胖和缓解糖尿病。此外，WAT 在寒冷暴露或β-肾上腺素能刺激后获得产热特性，被称为米色脂肪组织。这些过程也称为WAT褐变。由于BAT的含量低且在成人中减少，并且与 BMI 和肥胖呈负相关，因此 WAT 褐变在全球肥胖流行的背景下获得了很多关注。响应生理和环境变化（冷挑战、禁食、运动等）的白色脂肪组织褐变诱导受代谢活跃器官（BAT、米色 AT、肌肉、心脏等）释放内分泌和旁分泌因子的调节。最近的研究证明，BAT或米色 AT分泌的几种脂肪因子 [包括成纤维细胞生长因子21（FGF21）、Slit2-C、胰岛素样生长因子1（IGF1）] 可以诱导WAT褐变并促进代谢过程。这表明脂肪因子通过介导不同脂肪组织之间的串扰来充当 WAT 褐变的调节剂。最近，小细胞外囊泡（sEVs）已成为脂肪组织和远端器官之间一种新的细胞间通讯系统，用于运输脂肪因子。尽管之前的研究报道了 BAT 衍生的sEV （SEVS-BAT）通过调节受体细胞的耗氧量来促进能量消耗，并且据报道几种 sEV 脂肪因子（例如 miR-99b、eNAMPT）有助于调节脂肪组织或远端器官中的细胞代谢，但脂肪因子在sEV中的作用在 WAT 褐变中的作用仍然难以捉摸。

我们之前的研究表明，核磷蛋白3 （NPM3）在脂肪组织来源的 sEVs 中富集，可能是一种未定义的脂肪因子。核磷蛋白/核质蛋白（NPM）家族在整个动物界中大量表达，根据蛋白质序列可细分为四组：NPM1、NPM2、NPM3 和无脊椎动物 NPM 蛋白。NPM 的结构主要分为三个不同的区域：N 端结构域（蛋白质结合）、酸性结构域（组蛋白结合）和C端核酸结合结构域。最近，NPM1引起了人们的广泛关注，并在细胞核和细胞质之间穿梭，以调节染色质重塑、基因组稳定性、核糖体生物发生、DNA 复制和 mRNA 转录。然而，NPM3 的功能在很大程度上尚未阐明，尽管 NPM3 在脂肪组织中大量表达，但 NPM3 是否在脂肪发育中发挥作用或作为假定的脂肪因子仍是未知的。在这项研究中，我们确定了 NPM3 在调节 WAT 褐变和改善 HFD（高脂饮食）诱导的肥胖中的关键作用，结果暗示了未来潜在的抗肥胖策略。

结果

NPM3 的表征

为了验证NPM3是否携带脂肪因子的特征，首先在小鼠中检测了NPM3的组织分布，结果显示NPM3在BAT中表达最多，其次是腹股沟脂肪组织（iWAT）（图A）。我们还检测了NPM3在脂肪细胞和来自不同类型脂肪的干细胞（ASCs）中的表达，结果显示NPM3在棕色脂肪细胞中特异性富集（图B）。此外，我们注意到当小鼠处于冷暴露状态时，NPM3在血浆和iWAT中的表达上调，这表明脂肪组织的褐化增加了NPM3的表达。为了进一步验证BAT衍生的NPM3是否可以转移到其他组织，我们将EGFP标记NPM3的BAT （NPM3EGFP AAV感染BAT）移植到小鼠腹股沟部位。结果发现EGFP不仅可以在邻近的iWAT和肌肉中检测到，而且可以在远处的器官如肝、肺和脾脏中检测到。这表明NPM3可以通过循环输送到远处组织(图C)。此外，血浆NPM3与体重呈负线性相关（图D）。在肥胖中，我们注意到，与瘦小鼠相比，ob/ob小鼠的iWAT（图E）、eWAT（图F）和BAT（图G）中NPM3的表达水平显著降低。这些数据强烈提示NPM3具有脂肪因子的特性。

NPM3 通过稳定 PRDM16 mRNA 促进 WAT 褐变

为了进一步研究NPM3对WAT褐变的影响，我们在3T3-L1前脂肪细胞中上调或下调NPM3，然后进一步进行褐变诱导。首先，我们证实3T3-L1细胞可以成功诱导为棕色脂肪细胞。产热基因的表达因NPM3过表达而上调（图A），而因NPM3抑制而降低（图B）。在BAT和WAT衍生的原代脂肪干细胞中，NPM3对褐变分化的影响得到了进一步验证。考虑到棕色脂肪细胞数量的增加导致了高葡萄糖消耗，我们还检测了3T3-L1前脂肪细胞的葡萄糖消耗。在NPM3过表达组中，葡萄糖消耗的上调表明褐变过程增强，而当NPM3沉默时，这种作用受到损害(图C)。为了研究NPM3在体内WAT褐变中的作用，我们通过局部注射siNPM3敲除CL-316,243诱导小鼠的iWAT NPM3（图D）。我们注意到CL-316,243促进了所有产热标志物的表达，而当NPM3下调时，产热标志物的升高表达显著降低（图D）。组织学上，NPM3的敲低导致iWAT内多室脂肪细胞数量大幅减少，同时UCP1阳性细胞数量减少（图E），这意味着NPM3的敲低损害了WAT褐变。在冷暴露小鼠中，冷暴露诱导NPM3降低，褐变相关标记基因和UCP1蛋白的表达升高，均受到siNPM3处理的损害。这些结果表明，NPM3在体内和体外都参与了WAT褐变的调控。

由于NPM3已被报道为一种假定的 RNA 结合蛋白（RBP），因此在褐变诱导过程中检测到 NPM3 的细胞定位。在褐变诱导过程中，细胞核中NPM3的表达减少，细胞质中NPM3的表达增加。这表明NPM3可能参与了褐变相关基因的转录后RNA网络。进一步采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）法检测致热mRNA，寻找NPM3的结合靶点。由于缺乏合适的商业抗小鼠NPM3抗体，Flag-NPM3在3T3-L1前脂肪细胞中表达，用于RIP研究。我们注意到fag抗体可以检测到NPM3，而ACTB无法检测到（图F），这表明Flag-NPM3可以用于进一步的RIP检测。RIP实验结果显示，Flag-NPM3-IP样品中富集了EBF2、PRDM16、PPARγ、CIDEA，而未检测到aP2 mRNA，表明aP2不与NPM3相互作用，可以作为阴性对照（图G）。在检测到的NPM3产热靶标中，PRDM16的丰度最高。因此，我们进一步研究NPM3对PRDM16 mRNA的影响。考虑到rbp可以调节mRNA的稳定性，我们推断NPM3可能会增强PRDM16 mRNA的稳定性，从而增加PRDM16 mRNA的丰度。与非结合基因aP2相比，NPM3过表达显著延长了PRDM16 mRNA的半衰期（图H）。为了进一步验证PRDM16参与NPM3介导的WAT褐变，我们在有或没有NPM3过表达的3T3-L1前脂肪细胞中敲低了PRDM16。PRDM16的敲低导致NPM3过表达导致产热基因的表达受损（图I）。这些结果表明NPM3通过稳定PRDM16 mRNA促进WAT褐变。

NPM3 定位于 sEV

NPM3是一种没有分泌信号肽的蛋白，因此在血浆中检测到NPM3表明NPM3是通过某种载体转移的。近年来，脂肪因子通过sEV从一个组织转运到另一个组织的机制作为组织间通讯的重要机制备受关注。我们之前的研究也表明NPM3在来源于脂肪组织的sev中富集。因此，我们询问了NPM3是否也可以通过sEV运输。为了研究NPM3的细胞间转移，在3T3-L1前脂肪细胞中表达NPM3- egfp融合蛋白，在transwell实验中采用GW4869或calpeptin抑制sEV的释放。在transwell培养系统中加入抑制剂后，EGFP阳性细胞的数量显著减少（图A）。为了进一步研究NPM3的定位，采用差速离心方法从脂肪组织提取物（ATE）中分离出不同大小的EV（图B）。测定了不同类型囊泡的大小分布。根据囊泡直径将囊泡分为大囊泡（>1000 nm, lEVs）、混合囊泡（200-1000 nm, mEVs）和小囊泡（<200 nm, sEVs）（图C）。通过western blot检测不同样品中NPM3的存在，结果表明NPM3在sev中富集，而在混合或大型EV中富集（图D）。在蔗糖梯度缓冲垫上分离sev粗组分，进一步验证NPM3的定位，NPM3的存在模式与CD63 （sEV标记物）相匹配（图E）。为了确认sEV是否携带NPM3，我们用蛋白酶处理sEVs。在添加清洁剂（Triton-X）溶解sEV的脂质双分子层后，蛋白酶K处理能够消除NPM3。在缺乏Triton-X的情况下，NPM3表现出对蛋白酶K消化的抗性（图3F）。这些发现证实了NPM3定位于sEVs。

在BAT受损的sEVs-BAT介导的WAT褐变中敲低NPM3

先前有研究报道sEV-BAT通过调节受体细胞的耗氧来促进能量消耗。然而，sEVs-BAT是否也能调控WAT褐变尚不明确。采用不同的超离心和tei试剂分离sEVs-BAT，分别与3T3-L1共培养。两种不同方法分离的sEVs-BAT对产热基因的促进作用相同（图A）。考虑到NPM3和sEVs -BAT在WAT褐变调控中起着至关重要的作用，我们有理由推测NPM3在BAT中的下调会影响sEVs -BAT的褐变功能。因此，我们在BAT中通过siRNA处理敲低NPM3的表达，然后从处理过的BAT中分离sEV，将所得样品命名为sEV-BAT-sinpm3（图B）。在BAT中敲除NPM3对sev中产热相关mirna和mrna的表达没有明显影响（图C），也没有改变分泌sev的数量和质量。分别用sEVs-BAT和sEVs-BAT-siNPM3处理3T3-L1细胞和ASCs，用sEVs-BAT-siNPM3处理的细胞中WAT褐变标志物的表达明显受损（图D）。与基因表达结果一致，葡萄糖消耗增加表明sEVs-BAT组3T3-L1细胞褐变增强，sEVs- batsinpm3组褐变减弱（图E）。这些结果证实，在BAT中敲低NPM3会损害sEV-BAT介导的白色脂肪细胞褐变。

为了进一步研究NPM3对sEV-BAT诱导的体内WAT褐变的影响，我们将sEV-BAT和sEVsBAT-siNPM3每3天分别注射到C57BL/6小鼠静脉中，持续2周。IVIS成像显示，sEV主要存在于小鼠的肝脏，也存在于iWAT、eWAT和BAT中。小鼠给药sEV-BAT后，iWAT和eWAT中NPM3的表达上调，而给药sEV-BAT-sinpm3时，NPM3的表达无明显变化。与sEVs-BAT- sinpm3组相比，sews - bat处理的小鼠iWAT和eWAT中UCP-1阳性脂肪细胞更小且多室（图F）。此外，sEVs-BAT处理小鼠的iWAT和eWAT中PGC1α、CIDEA和UCP1的升高表达被NPM3敲低而受损（图G）。注射sEV-BAT可促进小鼠的耗氧量，而注射sEV-BAT-sinpm3后小鼠的耗氧量与正常小鼠相比无显著差异小鼠（图H）。此外，在冷暴露后，注射sEVs -BAT-sinpm3的小鼠比注射sEVs-BAT的小鼠更难以维持体温（图I）。这些结果表明，在BAT中敲除NPM3会损害sEV-BAT介导的WAT褐变。

在BAT中敲低NPM3减弱sEVs-BAT介导的HFD喂养小鼠的肥胖

先前有研究报道sEVs-BAT可以用于对抗肥胖，考虑到NPM3在WAT褐变中的作用，我们询问NPM3是否可以在sEVs-BAT介导的肥胖对抗中发挥作用。为了验证这种可能性，我们在小鼠成功诱导肥胖后，将sEV-BAT或sEV- batsinpm3静脉注射到HFD喂养的小鼠中，持续9周（图A）。sEVs-BAT在高脂肪小鼠中促进WAT褐变的作用与正常喂养小鼠一样。注射sEV-BAT限制了这种hfd诱导的体重增加，而当sEV-BAT中NPM3被抑制时，这种影响减弱（图B）。各组之间的累积饮食摄入量没有变化（图C）。与注射sEVs- BAT- sinpm3的HFD小鼠相比，注射sEVs-BAT的小鼠iWAT和eWAT质量显著降低（图D）。组织学研究表明，sEVs-BAT可以减轻hff诱导的脂肪肥大，而sEVs-BAT-sinpm3治疗组则不明显（图E）。sEVsBAT不仅改善了葡萄糖耐量和胰岛素敏感性（图F， G），还降低了空腹血糖（图H）。然而，当小鼠接受sEVs-BAT-siNPM3治疗时，这些效果不明显。此外，HFD小鼠注射sEVs-BAT后，iWAT和eWAT中IL-1β、IL-6等促炎基因的显著降低在sEVs- BAT-sinpm3注射HFD小鼠中并不明显（图I）。总之，在高脂饲料喂养的肥胖小鼠中，BAT中NPM3的下调会损害sEVs-BAT介导的体重减轻和胰岛素敏感性改善。

结论

该研究揭示了主要由棕色脂肪组织来源的 sEVs （sEVs-BAT）转移的核磷蛋白3 （NPM3）可通过调节 PRDM16 mRNA 的稳定性诱导 WAT 褐变。sEVs-BAT 增强了 3T3-L1 前脂肪细胞和 WAT 中褐变相关基因的表达，而敲除 BAT 中的 NPM3 会损害 sEVs-BAT 介导的肥胖 WAT 褐变和体重减轻。这些数据为 NPM3 在调节 WAT 褐变中的作用提供了新的见解，研究表明，补充 sEVs-BAT 可能代表一种有前途的治疗策略，可以促进未来产热和能量消耗。

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