《Journal of Ethnopharmacology》（Q1，IF=4.8）是国际民族药理学学会的官方期刊。该杂志致力于根据国际公约确立的原则，就人们使用植物、真菌、动物、微生物和矿物及其生物和药理作用进行信息和理解的交流。
导读
神经性疼痛是影响体感觉系统的病变或疾病的直接后果。神经性疼痛是许多神经系统疾病的常见症状。很大一部分神经性疼痛（NP）患者的疼痛缓解仍然不足，完全缓解仍然是一个梦想。此类报告允许NP的其他治疗选择。神经性疼痛是由影响体感觉神经系统的损伤或疾病引起的疼痛，极大地影响患者的生活质量。
流行病学研究表明，一般人群中神经性疼痛的患病率可能高达7-8%，占慢性疼痛患者的20-25% 。世界卫生组织估计，世界上22%的初级保健患者患有慢性衰弱性疼痛，这使得慢性疼痛成为所有医生和卫生专业人员需要解决的问题。下腰痛在喀麦隆的学龄儿童中很常见，其中12.3%患有下腰痛，并可能导致严重残疾。神经性疼痛通常用吗啡等阿片类药物治疗。目前可用于神经性疼痛（NP）的药物治疗由于疗效不完全和剂量依赖性的不良反应，只能提供微薄和部分的疼痛缓解。耐受性和依赖性是其他挑战，特别是长期使用阿片类药物。药物的可及性和可获得性存在问题，使这种病理成为公共卫生的一大挑战。
目前的药物治疗方案提供不充分和/或不充分的反应，因此NP的替代治疗仍然存在重大的未满足的临床需求。神经炎症、氧化应激及其相互关系在NP病理生理中起关键作用。在这方面，新兴的NP潜在治疗策略旨在通过靶向特定活性氧（ROS）源来增强炎症的消退阶段和/或恢复氧化还原平衡。通过筛选发酵食品中的益生菌来寻找新的药理活性物质，这些益生菌已显示出对神经病变具有抗炎和抗氧化作用的改善特性。
使用益生菌可能是成功管理神经性疼痛的有效策略。益生菌是活的微生物，当给予足够的量时，可以给宿主带来健康益处。乳酸菌通常被认为是安全的，被广泛用作益生菌，并被认为具有健康益处，如抗糖尿病活性、抑制癌症、抗溃疡、免疫调节、调节肠道微生物群、抗炎活性、抗氧化活性、抗感染性活性、减轻过敏和特应性疾病。
以往的研究表明，发酵牛奶和棕榈酒是具有益生菌特性的乳酸菌的丰富来源。喀麦隆和非洲其他地区的富拉尼人传统上加工牛奶，并用于治疗疟疾、便秘、疼痛、炎症、肝炎、结核病、发烧、泌尿系统问题和行为障碍。撒哈拉以南非洲的几个民族经常将草药与棕榈酒混合，以治疗大多数身体疾病、治疗细菌感染、减轻关节炎引起的疼痛、治疗炎症相关疾病、腹泻病和行为障碍。发酵乳和棕榈酒的治疗效果可能与益生菌乳酸菌的存在有关。
据我们所知，没有研究评估过棕榈酒和发酵牛奶中的益生菌对神经性疼痛的改善潜力。因此，有必要评估益生菌乳酸菌对慢性收缩损伤（CCI）引起的小鼠神经性疼痛的改善潜力：参与抗炎和抗氧化防御机制。
因此，本研究旨在评估从传统发酵乳和棕榈酒中分离的乳酸菌对小鼠模型慢性疼痛和炎症的缓解作用。
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候选益生菌的分离与鉴定
从传统发酵乳和棕榈酒中分别筛选出过氧化氢酶阴性和革兰氏阳性菌株100余株，均推定为乳酸菌。由于对酸和胆汁的抗性非常好，只选择了两个分离株（F1和F2）。这些选定的分离物用于评估神经性疼痛的改善潜力。通过16s rRNA基因测序对其进行了表型和分子鉴定。NCBI BLAST鉴定结果显示，F1与发酵乳酸杆菌的相似性为99.4%，与乳酸肠球菌的相似性为99.87%。将其16条S rRNA基因序列存入NCBI基因库，F1和F2的加入号分别为OR619545和OP896078。
孵育3h后，在pH=3条件下，分离株F1和F2的活力分别大于7.5log cfu/mL，与对照相比差异不显著。这些菌株在孵育4小时后对胆汁盐也表现出更高的耐药性。菌株对所有抗生素测试敏感，溶血试验阴性，因此显示出良好的益生菌候选。
选定的乳酸菌对冷性异常痛和机械性痛觉过敏的影响
坐骨神经慢性收缩性损伤引起的神经性疼痛导致异常性痛的显著发展，与假手术对照组相比，整体治疗组（阴性对照组）术后第7天和第14天后肢退出阈值分别下降至9.94±1.54s和5.83±0.61s。与阴性对照组相比，MF9 (2.7×109CFU/mL)剂量的乳酸菌F1(发酵Limosilactobacillus fermentum）对化学物质（丙酮）的反应在第7天和第14天分别减弱至13.75±0.81s和16.84±1.53s。乳酸菌F2 (Enterococcus lactis) MF9 （2.7×109 CFU/mL）处理后，与阴性对照相比，CCI诱导的第7天和第14天的断爪阈值分别降低至11.91±1.66s和16.74±1.61s。此外，吗啡改善了CCI诱导的痛阈下降（图A）。乳酸菌F1、乳酸菌F2和吗啡分别显著影响CCI诱导的神经性疼痛小鼠的断爪时间。
阴性对照CCI小鼠在第7天和第14天疼痛阈值水平（断爪时间）分别较假性对照组降低（7.04±0.6942s）和（2.86±0.2215s）。乳酸菌F治疗组疼痛阈值在第7、14天均呈剂量依赖性升高，其中MF9剂量（2.7×109 CFU/mL）在第14天与阴性对照组相比表达最高(15.83±0.7351s)。与阴性对照组相比，吗啡(10 mg/kg)的疼痛阈值水平（足部戒断时间）在第7天和第14天分别升高至10.81±0.51s)和15.20±0.74s)。此外，与阴性对照组相比，2.7x109 CFU/mL(MF9)剂量的F2乳酸菌治疗在第14天将减少的足部戒断时间逆转为14.63±0.5383s）。乳酸菌F2剂量依赖性地提高CCI诱导小鼠的疼痛阈值（图B）。
乳酸菌F1和F2对CCI所致开放性神经性疼痛小鼠运动、探索和焦虑样行为的影响
给药乳酸菌F1、F2和吗啡对CCI小鼠的运动活性有显著的剂量依赖性增加（交线）。乳酸菌F1和F2、吗啡给药量与阴性对照相比，显著影响饲养次数。
CCI诱导后，车辆处理组（阴性组）的杂交和育代次数分别为57.0±7.6次和14.3±1.8次，显著低于假对照组。与阴性对照相比，乳酸菌F1在2.7×109 CFU/mL(MF9)剂量下呈剂量依赖性增加，杂交和饲养数量分别为140.5±10.2和44.2±4.5。此外，菌株F2在2.7×109 CFU/mL(MF9)剂量下显著恢复CCI诱导的杂交和育代频率降低，分别为147.0±7.6和32.2±2.8。与阴性对照组相比，吗啡治疗组杂交株数和育代株数分别为146.0±9.5和43.5±8.8。与阴性对照组相比，经分离F1(MF9)处理的CCI小鼠在术后第14天的梳毛次数从阴性对照组的14.0±0.4次显著降低至7.5±1.9次。分离株F2(MF9)梳毛次数降至8.0±1.7次。此外，与阴性对照组相比，吗啡逆转了CCI诱导的梳洗次数增加至9.5±2.6次。此外，单向方差分析显示，乳酸菌F1和F2以及吗啡对CCI小鼠梳洗次数有显著影响。
乳酸菌F1和F2对CCI诱导小鼠神经性疼痛氧化应激生物标志物的影响
与假对照组相比，CCI诱导导致车辆处理组（阴性对照）坐骨神经一氧化氮和丙二醛浓度升高，坐骨神经还原性谷胱甘肽浓度、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性下降。
单因素方差分析显示，乳酸菌F1和F2对CCI诱导的神经性疼痛小鼠MDA水平有显著影响。与阴性对照组相比，MF9剂量F1乳酸菌处理组丙二醛浓度从阴性对照组的21.78±1.14 μmol/g显著降低至10.91±0.23μmol/g。乳酸菌F2在MF9剂量下，MDA水平降至15.88±1.91 μmol/g。与阴性对照组相比，吗啡显著改善了CCI诱导的MDA浓度升高（10.26±0.73μmol/g)（表2）。
假手术组坐骨神经一氧化氮浓度由阴性对照组（2.45±0.26μM/mg)显著升高至4.30±0.56 μM/mg。以MF9剂量口服F1乳酸菌和吗啡可显著降低其含量，分别为63.14±2.57 μM/mg和62.15±2.65 μM/mg（表2）。此外，单因素方差分析显示，F1乳酸菌和F2以及吗啡对坐骨神经组织一氧化氮水平有显著影响。
乳酸菌F1在MF6(1.8×109 cfu/mL)和MF9 （2.7×109cfu/mL）剂量下使坐骨神经过氧化氢酶浓度分别从0.20±0.04 U/mg 和0.42±0.04 U/mg显著升高。以MF9剂量口服乳酸菌F2使组织过氧化氢酶活性提高至0.30±0.04 U/mg。吗啡能显著提高坐骨神经过氧化氢酶活性，达到0.48±0.04 U/mg。此外，单因素方差分析显示，乳酸菌F1、F2和吗啡对坐骨神经过氧化氢酶活性有显著影响。
单因素方差分析表明，乳酸菌F1、F2和吗啡治疗显著影响CCI诱导的神经性疼痛小鼠的SOD浓度。SOD浓度由阴性对照组（23.33±5.48 U/mg）降至假对照组（15.16±0.70 U/mg） 。乳酸菌F1诱导SOD浓度呈剂量依赖性增加，与阴性对照相比，最高剂量（MF9）诱导的SOD浓度增加高达22.4±0.76 U/mg。乳酸菌F2的MF9剂量使组织中SOD浓度升高至18.33±1.15 U/mg。与阴性对照组相比，吗啡治疗组SOD浓度明显升高。
单因素方差分析显示，乳酸菌F1和F2以及吗啡治疗对CCI小鼠坐骨神经GSH浓度有显著影响。乳酸菌F1处理组坐骨神经还原性谷胱甘肽水平(1.41±0.09 μmol/mg组织)显著高于阴性对照组(2.36±0.12 μmol/mg织)和3.82±0.36 μmol/mg组织。乳酸菌F2(MF9)使还原性谷胱甘肽水平提高至1.98±0.42 μmol/mg 。与阴性对照组相比，吗啡使CCI降低的还原性谷胱甘肽恢复到3.75±0.37μmol/mg组织（表2）。
乳酸菌F1和F2对CCI致小鼠神经性疼痛中髓过氧化物酶（MPO）、总钙和环氧化酶2的影响
单因素方差分析显示，乳酸菌F1和F2以及吗啡治疗对CCI诱导的神经性疼痛小鼠髓过氧化物酶水平有显著影响。CCI后14天，我们发现，与假对照组(12.53±1.29 U/min/mg)相比，车辆治疗组（阴性对照）坐骨神经髓过氧化物酶活性（MPO）(147.92±10.92 U/min/mg)显著增加。与阴性对照组相比，MF6和MF9剂量F1乳酸菌处理CCI小鼠，髓过氧化物酶水平分别显著降低至47.42±7.66 U/min/mg和16.86±2.31 U/min/mg。同样，乳酸菌F2在MF9剂量下可使组织中髓过氧化物酶水平降低34.54±12.76 U/min/mg。此外，吗啡显著使髓过氧化物酶水平升高至13.12±1.63 U/min/mg（图A）。
与阴性对照组相比，乳酸菌F1和F2以及吗啡治疗显著剂量依赖性地降低了钙水平。与假对照组相比，CCI小鼠(阴性对照组)坐骨神经总钙水平(39.39±2.08 ppm/mg组织)显著升高。与阴性对照组相比，MF9剂量F1乳酸菌口服和吗啡治疗显著降低了坐骨神经总钙水平，分别从阴性对照组的39.39±2.08 ppm/mg降低到4.54±0.94 ppm/mg和4.59±0.60 ppm/mg。此外，乳酸菌F2在MF9剂量下降低CCI诱导的组织总钙增加至26.74±2.27 ppm/mg（图B）。
与阴性对照组相比，口服乳酸菌F1和F2以及吗啡治疗导致血清环氧化酶2水平显著的剂量依赖性降低。阴性对照小鼠(载药CCI小鼠)血清环氧合酶2由假手术对照组的6.13±1.05 ng/mL显著升高至78.39±5.81 ng/mL。乳酸菌F1在MF6和MF9剂量下，与阴性对照组相比，血清环氧化酶2浓度分别从78.39±5.81 ng/mL降低到28.18±4.10 ng/mL和15.54±2.92 ng/mL，呈剂量依赖性显著降低。此外，乳酸菌F2处理导致处理组血清环氧合酶2浓度降低。与阴性对照相比，吗啡（10 mg/kg）显示血清环氧化酶2水平下降（图C）。
乳酸菌F1和F2对小鼠慢性缩窄性神经性疼痛炎性细胞因子的影响
为了评估候选益生菌对神经炎症的影响，我们在术后14天测量了小鼠血清中TNF-α、INF-δ、IL-6、IL-1β和IL-10的水平。我们观察到，与羞耻感组相比，CCI诱导的神经性疼痛导致TNF-α、INFγ、IL- 1β、IL-6水平显著升高， IL-10 水平显著降低。
假手术对照组小鼠血清TNF-α水平由175.4±22.53 pg/mL升高至357.6±20 pg/mL。乳酸菌F1可显著降低TNF-α水平，并呈剂量依赖性。乳酸菌F1 MF9剂量处理CCI小鼠后，与阴性对照组相比，TNF-α水平从阴性对照组的357.6±20 pg/mL显著降低至183.30±8.24 pg/mL。MF9剂量的乳酸菌F2处理小鼠，恢复到193.20±5.55 pg/mL。吗啡(10mg/kg)也使TNF-α值降低至171.7±7.828 pg/mL（图A）。
阴性对照组的INF-γ水平由假手术组的141.5±6.132 pg/mL显著升高至368.5±3.36 pg/mL。干扰素γ浓度从阴性对照组的368.5±3.36 pg/mL显著降低到MF6和MF9剂量F1乳酸菌组的234.5±7.10 pg/mL 和150.4±8.01 pg/mL。乳酸菌F2（MF9）逆转作用至268.7±4.196 pg/mL。吗啡组观察到类似的结果（图B）。
坐骨神经CCI导致阴性对照组INF-γ浓度从假手术组(141.5±6.132 pg/mL)显著升高至阴性对照组(368.5±3.36 pg/mL)。然而，与阴性对照组相比，口服乳酸菌F1分别以剂量依赖的方式降低了IL-6水平。MF6和MF9剂量F1乳酸菌诱导CCI小鼠IL-6水平分别从阴性对照组的480.4±13.36 pg/mL显著降低至308.80±6.66 pg/mL和307.7±5.09 pg/mL 。用乳酸菌F2处理小鼠，可呈剂量依赖性地降低CCI诱导的血清IL-6水平升高。吗啡对CCI的影响也恢复到312.7±3.677 pg/mL（图C）。
与阴性对照组相比，乳酸菌F1处理显著降低了CCI小鼠（阴性对照组）的血清IL-1β浓度。与阴性对照组相比，假手术组血清IL-1β浓度从157.5±3.45 pg/mL升高至336.6±9.40 pg/mL， MF6和MF9剂量F1乳酸菌组血清IL-1β浓度分别降至255.5±5.0.7 pg/mL 和156.2±4.8 pg/mL。吗啡也将CCI的作用逆转至166.40±4.66 pg/mL（图D）。口服乳酸菌F2显著降低CCI小鼠IL-1β水平，且剂量为MF9时效果最大（图D）。
CCI小鼠（阴性）的血清IL-10浓度显著降低。乳酸菌F1分别以剂量依赖的方式显著逆转这种神经性疼痛。与阴性对照组相比，MF6和MF9剂量F1乳酸菌组血清IL-10浓度分别从阴性对照组的130.7±4.30 pg/mL升高至285.60±5.04 pg/mL和320.90±1.34 pg/mL 。乳酸菌F2组MF6和MF9组il - 10浓度分别升高至272.60±6.53pg/mL和285±4.25 pg/mL。吗啡（10mg/kg）使il - 10浓度升高至333.3±2.90 pg/mL。
乳酸菌F1和F2对小鼠坐骨神经CCI所致坐骨神经结构紊乱的影响
坐骨神经组织苏木精和伊红染色镜检显示，假手术组组织学外观正常，神经束神经纤维紧密堆积。髓鞘神经纤维中可见轴质，周围有未染色的髓鞘解体区。神经纤维和少见的神经内膜血之间可见雪旺氏细胞核（图A）。相反，在CCI诱导的小鼠（阴性对照）中，神经组织显示神经纤维变性，胶原和髓鞘纤维降解，雪旺氏细胞局部变性（图B）。与阴性对照相比，乳酸菌F1 （MF6和MF9）的处理导致典型的神经束，神经内膜间隙分别有髓鞘神经纤维和雪旺细胞核，神经纤维略有分离（图D和E）。此外，乳酸菌F2剂量下的MF6和MF9处理的CCI小鼠的部分显示神经囊泡和神经纤维结构略有增加。与阴性对照组相比（图H）。吗啡治疗组神经囊泡的正常结构得到部分恢复，大部分神经纤维完好无损，彼此之间仅有轻微分离（图I）。
结果
我们的研究结果表明，发酵乳酸杆菌（F1）和乳酸肠球菌（F2）具有良好的酸和胆汁耐受性，因此是益生菌的候选菌。发酵乳酸杆菌和乳酸肠球菌在CCI诱导的小鼠神经性疼痛中表现出抗伤性作用，其机制包括：减少坐骨神经钙沉积、抗氧化活性和抗炎特性（抑制促炎细胞因子和COX-2）。此外，与乳肠球菌（F2）相比，发酵乳酸乳酸杆菌（F1）对神经性疼痛的改善效果更好。益生菌在行为和分子水平上介导神经性疼痛病理生理的衰减，表明它是一种有前途的治疗神经性疼痛的药物。
