盐酸溴己新有关物质的超高效液相色谱方法开发

盐酸溴己新片是呼吸系统祛痰类非处方药，临床上主要用于急慢性支气管炎、哮喘、支气管扩张、肺气肿的治疗，为国家基本药物。有关物质是药品质量控制的重要内容，药物的杂质谱也是比较仿制药与原研药质量一致性的重要内容^[1]。另外，对未知杂质的分析也能够为完善工艺和质量标准并进一步提高产品质量奠定基础。

现行 2020 版药典二部^[2] 采用液相色谱结合乙腈和磷酸盐的等度方法，仅对一种已知杂质（杂质 I）和总杂进行控制；欧洲药典 (10.0)^[3] 同样采用液相色谱等度分析方法，对 5 种已知杂质和其他未指明杂质以及总杂含量进行控制。随着对色谱条件的优化以及对盐酸溴己新杂质研究的不断深入，李文东^[4]、马欢^[5] 等已经建立了能够同时检测更多杂质的常规液相色谱分析方法，用于实际药物质量控制领域，但常规分析方法时间长，分析效率低，试剂消耗量大。本文采用超高效液相色谱 (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC)，借助安捷伦自动方法开发向导 (MSW)，构建了能同时分析 15 种有关物质的快速分析方法；并使用 ACD/Labs 软件对影响分离的关键因素的可调整空间进行了系统研究。

乙腈和甲醇为色谱级，购于 J.T.Baker 和 Avantor 公司；磷酸为 HPLC 级，浓度 85%，购于 Dikma；醋酸铵为 HPLC 级，购于 CNW；甲酸和乙酸为 LC-MS 级，购于上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水为通过 Millipore 纯水机制得的去离子水 (18.2 MΩ)；杂质 A、B、C、D、E、F、Ia、Ib、K、L、M、N、 O、Q 和 R 均由成都新恒创药业有限公司提供（纯度 > 98%，供鉴定用）。盐酸溴己新原料药由国内客户友情提供。盐酸溴己新及其杂质的结构信息见表 1。

表 1. 盐酸溴己新和 15 种有关物质的化学信息

采用 Agilent 1290 Infinity II 方法开发系统，配备如下模块：Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A)、Agilent 1290 Infinity II样品瓶进样器 (G7129A)、Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B)、Agilent 1290 Infinity II 二极管阵列检测器 (G7117A)。

色谱柱选用 Agilent Zorbax Eclipse Plus RRHD C18（2.1 × 100 mm, 1.8 µm，部件号 959758-902）。

软件采用 Agilent OpenLab CDS ChemStation，版本 C.01.10，附带 Agilent ChemStation 方法筛选向导 A02.06 版；ACD/Labs AutoChrom 软件，2021 版。

取盐酸溴己新原料药样品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每 1 mL 中约含 5.0 mg 的溶液；再精密称取 15 种有关物质适量，加甲醇溶解并最终稀释制成浓度约为 10 µg/mL 的混合对照品溶液。分别取样品溶液和有关物质的混合对照溶液适量，按照 1:1 混合，混匀后经 0.22 µm 有机膜过滤，用作方法筛选和优化的系统测试溶液，上机分析。

首先采用甲醇和醋酸铵缓冲盐体系 (pH = 5.5)，以 Zorbax Eclipse Plus RRHD C18 (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) 作为分析柱，流速0.4 mL/min，参考已有常规分析方法^[5]，转换成 UHPLC 方法作为起始实验方法。然后采用安捷伦自动方法开发向导 (MSW) 开展多因素多水平实验进行色谱条件筛选，并利用 MSW 智能报告模板确定“最佳”分析条件并总结谱图中关键峰的保留随不同因素变化的总体特征。然后采用 ACD/Labs AutoChrom 软件的 LC Simulator 模块，建立影响分离的各关键因素的单因素及双因素模型，挖掘目标峰分离的变化规律，确认关键因素的可操作范围。最后对预测得到的边界条件进行单次实验的确认，并做适当微调，最终得到方法可操作空间。

图1. 方法开发流程

受色谱柱差异的影响，转换成 UHPLC 的起始实验条件并不能较好分离 15 种有关物质，因此利用自动方法开发向导 (MSW) 对流动相 pH 值、梯度和柱温三个因素的三个水平进行排列组合得到的条件进行筛选，再用智能专用模板快速确认该组合条件下最优分离结果及其色谱条件。从图 2A 所示的色谱峰数量泡泡图可以看出，第 9、10、23 和 31 次实验均获得了较多的色谱峰，结合图 2B 所示的最小分离度泡泡图，确定采用第 23 次实验的色谱条件作为目前三因素三水平组合下最佳的分离方法。具体条件如下：

A

B

图 2. MSW 智能报告模板：(A) 最多色谱图数量泡泡图；(B) 最小分离度泡泡图

采用ACD/Labs AutoChrom 软件的 LC simulator 模块，围绕柱温、pH 值及梯度建立单因素和双因素模型，进一步挖掘各因素对分离影响的规律，以确认关键因素的可调空间。从图 3A 所示的 pH 单因素模型可以看出，分离度对 pH 值的变化非常敏感，以pH = 5.4、5.5、5.6 和 5.7 时获得的分离谱图（如图 4）为例，可以发现杂质 D 和 L 的保留时间随 pH 提高而增加，杂质 A 和 K 的保留时间不随 pH 增加而变化，导致杂质 A 和 D 之间以及杂质 L和 K 之间的分离度随 pH 增加而提高，而杂质 Ia 和 Ib 的分离度逐渐变差。综上分析，预测 pH 的可调范围为 5.45–5.65。

图 3B 的梯度模型结果显示，关键峰的分离度随梯度时间减小呈先升高而后降低的规律。进一步观察实际谱图，缓梯度利于目标峰 Ia 与 Ib 的分离，但会降低目标峰 M 与 R 的分离，通过模型预测最佳梯度点在 17 min。考虑到 M 与 R 的分离度，12–17 min均可作为梯度终点，进行后续验证。

从图 3C 所示的柱温单因素模型结果 2 可以发现，提高柱温有利于峰 A/D 和 L/K 分离，但会降低 Ia 与 Ib 的分离。以 Ia 和 Ib 为关键峰对，在柱温区间 38–45 °C 内均能满足分离度 ≥ 1.5 的要求。

A

B

C

图 3. 以 pH 值 5–6 (A)、pH 值 5.4–5.7 (B)、梯度 (B) 及柱温 (C) 等因素建立单因素分离度模型所得到的结果

图 4. 在流动相的水相 pH 值分别为 5.4、5.5、5.6 和 5.7 的条件下所得到的系统测试溶液色谱图

A

B

C

图 5. 柱温-梯度 (A)、pH-梯度 (B) 以及 pH-柱温 (C) 的双因素模型结果，红框内包含感兴趣的次优解范围

考虑到各影响因素之间的交互作用，本文还构建了柱温-梯度、pH-梯度和 pH-柱温等双因素模型，进一步确认各因素的可操作空间。从图 5A 所示的柱温-梯度模型结果可以看出，柱温38–45 °C，结合 12–19 min 梯度的区间范围内，整体分离度 ≥ 1.5，可作为两个因素的可操作区间。同样从图 5B 所示的 pH-梯度双因素模型结果发现，在 pH 为 5.45–5.65 且梯度时间为 12–18 min的区间内，目标峰的分离度均满足 ≥ 1.5 的要求。另从图 5C 所示的 pH-柱温模型结果可以得出，在 pH 为 5.45–5.65 和柱温为38–48 °C 的范围内，可获得相对稳定的分离区间。综上分析，利用 ACD/Labs 的 LC simulator 模型预测该方法的可操作区间为：柱温 38–45 °C，pH = 5.45–5.65，梯度终点在 12–18 min。

由于因素和因素间存在相互影响，基于前述各影响因素的可调范围，次优解区间内存在部分边界不满足分离要求的情况。如图 6 所示：从图 6A 可以看出，在特定 pH 和温度边界，采用 17 min 的较长梯度时间虽然能显著提高杂质 Ia 与 Ib 的分离度 (R = 1.85)，但杂质 M 与 R 的分离度不佳 (R = 1.18)；如图 6B/C/D 所示，梯度时间 12–14 min，此时杂质 Ia 与 Ib 的分离度为 1.46–1.86，杂质M 与 R 的分离度为 1.49–1.64。如图 6C，在 pH = 5.45 的边界值条件下，12 min 的梯度时间，关键峰对 M 和 R 以及 Ia 和 Ib 的分离度符合要求，杂质 A 和 D 以及 L 与 K 的分离度不足，图 5B 和5C 也提示了 pH 5.45 的临界情况。而在 pH = 5.65 的边界值条件下，杂质 A 和 D 以及 L 和 K 分离度均 ≥ 1.5，因此 pH 可调范围为5.5–5.65。在柱温范围确认中，分别采用 40 °C 和 45 °C，同时结合梯度时间 12 min 和 pH = 5.65 进行验证，关键峰对 M 和 R 以及 Ia 和 Ib 的分离度均能 ≥ 1.5，但柱温提高时导致后者的分离度下降。在本实验中，将柱温边界确定为 40–45 °C。

另外，本文采用 ACD/Labs AutoChrom 软件的 LC simulator 模块，在梯度的单因素模型中增加一个梯度拐点，优化关键峰对 M 和 R 以及 Ia 和 Ib 的分离，提高耐用性空间。梯度条件：0–6 min，36%–72% B；6–20 min，72%–85% B；20–25 min，85% B。采用该两步梯度对测试样品进样分离，并验证边界 pH（5.5 和 5.65）下的分离结果，如图 7 所示。从图中可知，各峰分离均能满足分离要求，其中杂质 M 与 R 分离度为 1.81，杂质 Ia与 Ib 的分离度为 1.79–1.91。

综上所述，最终确定的盐酸溴己新及其 15 种有关物质的 UHPLC分析条件总结见表 2。

图 6. 分别采用以下色谱条件来验证各关键影响因素的可调整范围：(A) 梯度时间17 min，pH = 5.5，柱温 = 40 °C；(B) 梯度时间 14 min，pH = 5.5，柱温 = 40 °C；(C) 梯度时间 12 min，pH = 5.45，柱温 = 40 °C；(D) 梯度时间 12 min，pH = 5.65，柱温 = 40 °C

图 7. 采用优化出的两步梯度法分别在 pH = 5.5 (A) 和 pH = 5.65 (B) 的条件下得到的样品分离谱图

表 2. 最终确定的主要色谱条件

本文建立了盐酸溴己新及其 15 种有关物质的超高效液相色谱快速分析方法。实验采用自动方法开发系统 (MDS) 对影响目标物分离的关键因素 pH 值、柱温和梯度进行了系统筛选和优化，并确定了最优化的条件。实验过程中发现杂质 A 和 D 以及 K 和 L 的分离对 pH 值变化较敏感，柱温对杂质 M 和 R 以及 Ia 和 Ib 的分离度影响较大，而梯度对杂质 Ia 和 Ib 的分离有重要影响，且梯度坡度越大越利于杂质 Ia 和 Ib 的分离。基于获取的各因素组合的实验数据结果，采用 ACD/Labs 构建单因素和双因素模型，探讨了各目标杂质峰分离的变化规律，确定了各因素可调整的范围，结合具体的单次实验的实际验证，最终确定了色谱条件。整个方法开发过程是以安捷伦 UHPLC 自动化技术为基础，以质量源于设计 (AQbD) 为理念，结合 ACD/Labs AutoChrom 软件的建模功能，挖掘因素对分离影响的变化规律并预测可调整的范围，确认并规避潜在的风险因素，从而保证方法耐用性和后续的方法转移上的成功率。