如何科学合理地
选择方法开发模式
从方法开发中引入“质量源于设计”的概念和ICH Q14“分析方法开发”指南的公布以来，可以看到实验室对分析方法的稳健性和方法生命周期管理、维护的相关研究和报道越来越多。
在不同的指导原则中，方法稳健性研究成为了新的重点，ICH Q14提到了在进行分析方法开发时，可使用基础（即传统）方式或增强方式，但由于基础（即传统）方式在方法开发过程中存在着知识空间不明确的风险，进而导致分析方法的稳健性风险，因此仍鼓励对方法进行系统的增强方式研究，如实验设计(DOE)等手段。
DOE是一种完善的工具，需要在确定方法的分析目标（ATP）后，基于全面的先验知识和科学的风险评估，采用不同的计算机软件（如ACDLab、DryLab等）或统计学工具（Minitab、JMP等）设计针对关键方法参数(CMPs)的多组单因素或多因素交互作用的试验，预测方法可操作空间（MODR），制定合理的控制策略，并将该方法验证转移后应用于产品整个生命周期的质控。同时强调了采用增强方式进行方法开发时，开发研究期间获得的数据（如DOE）可用作相关分析方法验证数据的一部分，并为生命周期管理提供更大的灵活性。当产品在检测放行和稳定性考察期间遇到方法问题时，能基于对方法可变性来源的全面理解快速追溯到可能的原因，并作出是否进行变更或重新开发的判断，若调整后的方法参数仍在多维可操作空间中，则不需要额外通知监管机构。如下文献[1]中的描述：
对于AQBD的应用，不同的方法和目的，关键的方法属性和参数不一，所需要评估的范围、工具和设计的DOE试验也不一致，需要具体项目具体分析，近年来对于AQBD的文献研究非常多，有很多可以值得借鉴的，如下面的这些案例：
(1) 通过计算机辅助分离建模，对活性药物成分中的阴离子进行通用方法开发案例 [2]
本文目的是为了开发一个通用方法用于检测常见的阴离子。筛选了三种不同的IC色谱柱(Dionex IonPac AS28-Fast 4µm, AS19 4µm和AS11-HC 4µm)，以确定最适合通用IC方法开发的色谱柱，然后使用确定的AS11-HC 4µm柱开发通用IC方法，在36分钟内分离31种最常见的阴离子，并利用LC模拟软件（ACDLab/Simulator）对该方法进行了优化，建立了能准确预测31种阴离子保留行为的模型用于验证。如下表：
上表表示：在筛选条件下，采用三种不同色谱柱对24种分析物进行Rs测定的结果。（Good: Rs>1.5，Ok: 1.5> Rs>0.9；Poor: 峰共洗脱或Rs < 0.9）
Fig2 所示：筛选的3根色谱柱结果。1、氟离子 2、乳酸3、乙酸 4、甲酸 5、甲磺酸 6、丙酮酸 7、氯离子 8、亚硝酸盐 9、三氟醋酸 10、溴离子 11、硝酸盐 12、琥珀酸13、碳酸盐 14、亚硫酸盐 15、硫酸 16、草酸 17、富马酸 18、磷酸 19、硫代硫酸盐 20、柠檬酸 21、甲苯磺酸 22、碘离子 23、三氟甲磺酸 24、焦磷酸。
紧接着，在确定的色谱柱下，使用ACD/LC Simulator软件对关键的方法参数柱温(25、30、40℃)和梯度洗脱时间(40、60、80 min)进行优化和模拟，寻找可操作空间，结果如下（高色温区）：
Fig3 所示：a)具有代表性的模拟图。b)采用优化后的通用IC法，在AS11-HC 4µm柱（预测与实验）上的31种（上述24种及其他7种相关化合物）阴离子分离结果
最终优化后的方法可在36分钟内分离API中31种常见阴离子。通过应用计算机辅助分离建模工具，建立了精确预测每种阴离子分析物保留行为的模型，并利用该模型对通用IC法的色谱条件进行优化。总的来说，这项工作不仅提供了一种简单的方法来分析API中常见的阴离子，而且为未来不同应用中各种离子的IC方法开发提供了有效的策略。
(2) 采用AQBD建立了超高效液相色谱法测定醋酸氟西诺酮原料药和外用油制剂中的杂质案例[3]
图2所示：(1) 醋酸氟西诺酮及其部分杂质结构
Fig3所示：醋酸氟西诺酮有关物质方法参数的风险评估的鱼骨图
该文根据化合物结构评估了6组关键方法参数，预计多个因素对保留或分离有较大影响，因此一个有益的筛选设计是必要的，以消除无影响和影响较小的因素。一般来说，部分因子设计、全因子设计、Plackett-Burman、Taguchi和Split-Plot优化设计等均可用于CMP的筛选。本研究采用D-最优分割图设计筛选影响最大的参数，共创建了44个实验设计，最终得到的CMPs和初步方法为：25 mM KH2PO4为流动相A, 70% ACN为流动相B，流速0.5 ml/min，柱温50℃，流动相B:流动相A（80:20）为初始梯度组成，Acquity UPLC HSS C18柱为固定相。然后再利用响应面法 (CCD)对筛选实验得到的参数进一步优化，确定MODR，如下表：
Fig4 所示：响应的正态图和三维响应面图
采用上述研究确定方法操作空间和最终方法后，并对方法进行了详细的验证。
(3) 采用AQBD建立具有稳定性指示作用的盐酸维拉帕米片有关物质方法的案例[4]
Fig5 所示：(a) VPM及其相关杂质结构
Fig6 所示：ID1~13分别对应结构编号为：a~m的不同pH-logD曲线叠图
该文献根据化合物结构，采用Placket-Burman实验设计评估影响色谱响应(Y)的最相关分析条件(X)，包括20个实验，见下表：
通过上述Placket-Burman筛选出关键参数，再通过统计学软件找到最佳设计空间，从而确定最终的方法参数，并对方法耐用性进行了评估。
(4) 使用多维分析设计空间来确定色谱柱的等效性[5]
在方法开发过程中，通常会探索具有不同(“正交”)选择性的固定相，但在方法验证期间，需要找到具有相同或相似选择性的备用或替代色谱柱，以避免因主色谱柱的市场可用性中断或批间重现性较差（非常常见）而导致的项目延迟。目前有多个色谱柱信息平台（例如Tanaka和Snyder-Dolan测试）可以提供一些关于色谱柱选择性对比的参考（通常认为FS＜3是等效），但有的较新的色谱柱还没有相关参数。然而，在实际的应用中往往有的时候数据库预测的准确性有一定的偏差，特别是考虑到缺乏更详细的一些条件，在这种情况下，使用多变量建模工具是非常有益的。本文总共使用了5个C18修饰的超高高效液相色谱(UHPLC)柱，针对氨氯地平及其相关杂质的分离，确定了不同色谱柱设计空间(DS)之间的等效性。相反，在某些情况下，尽管色谱柱数据平台预测相似性良好，但却表现出明显的差异。所选色谱柱的参数如下：
Fig7 所示：所选固定相的雷达图
使用上述不同色谱柱，分别研究了各杂质在不同参数之间（pH、柱温和梯度）的分离情况和可操作空间，如下图所示。
Fig8 所示：选定固定相的设计空间和红色MODR区域的模型识别。
通过比较和叠加单个MODR，可以确定一个共享的色谱柱间的MODR，其中所有色谱柱至少可以实现基线分离。然后可以利用这个空间，例如，建立适用于各种固定相的常规检测方法。这种共享MODR区域的存在也意味着某些固定相不仅可以达到基线分离结果，而且还可以提供相当甚至等效的选择性。
Fig9 所示：在不同温度(20℃和40℃)下两个选定工作点的比较
从上图可知，除了BEH C18和Hypersil Gold C18难以分离两个关键杂质(Imp B和G)，其他色谱柱分离良好。值得注意的是，在这些条件下，HSS C18、Zorbax SB-C18和HSS C18 SB的总体选择性惊人地相似，但实际上数据库的信息显示这些色谱柱的Fs相差是较大的。然而，增加温度到40◦C导致峰以不同的速率移动，大大改变了色谱行为，受这种温度变化影响最大的峰是Imp B-G-H。同样对比了同一系列的C18和C8的选择性，如下图：
Fig10 所示：DS模型的C8和C18两种固定相的模型色谱图
总的来说，该文献研究的结果表明，只有在基于AQBD的建模解决方案的帮助下，才能对色谱柱提供的选择性进行更合理的评估。使用多元色谱分析系统的一个显著优势是它们能够在每个研究的分离系统中提供复杂色谱变化的描述。
上述案例涉及的色谱方法开发过程中，ICH Q14推荐的“增强方式”显示了很大的优势：
1、缩短了方法开发的周期，减少了大量的实验。
增强方式下，色谱参数的筛选和优化过程被分为两个阶段。流动相pH值、有机相比例、梯度程序、柱温等连续型变量，均可以通过数学建模的方式，“计算”出所选范围是否有最优条件，避免了“传统方式”下的大量冗余的实验，降低人力、试剂、耗材等成本。
2、通过构建模型，有助于加深对AQBD的理解，快速识别风险点。
几年前，分析的小伙伴们通过对文献的学习以及萧柏明老师的培训，开始基于“质量源于设计”理念采用色谱模拟技术进行分析方法开发，在此期间，多个项目通过DoE实验构建知识空间（MODR），能快速找到影响色谱分析方法性能的关键参数，并为将来的分析技术转移奠定了基础，降低了转移失败的风险，当在方法转移过程中出现问题时，通过前期MODR积累的知识也能更快速解决。
当然，并不是所有的方法开发都需要采用系统完整的增强方式，如上述案例有的可根据需要进行部分增强方式的开发，也有的如一些简单的含量、溶出或杂质个数很少的有关物质方法开发时，基于理论知识的判断采用传统方式能很快得出正确的开发方向，并在确保方法没有太大风险的情况下进行筛选和优化，也是可以接受的，但需要注意的是即使采用传统的方式进行开发，也是基于科学的理论知识进行判断，而不是盲目试错得出的结果。比如下面的这组化合物，很明显不需要筛选不同pH的范围，也不需要筛选缓冲液的类型和浓度这些对于酸碱基团是关键因素的参数。
所以，当我们拿到化合物的时候，我们应该首先观察化合物结构特点，是否含有酸碱基团（pH很关键），是否有异构体（手性化合物必须手性环境），软件预测极性大小（logD/logP）和pKa范围是多少（选择合适的缓冲盐），有哪些作用位点（如氢键、偶极-偶极、π-π、离子交换、疏水作用、空间位阻、金属络合等），是否有紫外吸收（DAD、MS、FID、ELSD或CAD等），是采用正相还是反相，是否需要采用离子对、离液剂、混合型色谱体系或使用其他特殊添加剂等，再结合方法开发的目的，综合评估是采用传统方式还是增强方式或是两者皆采用。此外，对于一些仿制药的品种，还需要结合现有药典标准的方法分离情况，为了降低申报的风险，若药典方法并无致命弱点，通常尽量选择与药典方法一致更好，当药典方法无法完全满足要求时，可以考虑额外增加方法作为药典方法的补充（主要有关物质），也可以推翻药典方法重新开发，但前提是新的方法对杂质的检出能力更优才去挑战。
以上观点仅供参考，请大家指教。
参考文献
