色谱模拟的基础知识
第二节 梯度的模拟
AutoChrom指南：背景知识
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第一章 色谱模拟的基础知识
第二节 梯度的模拟
第三节 温度的模拟
第四节 溶剂类型的模拟
第五节 pH的模拟
第六节 正相洗脱强度模拟
梯度洗脱可用于处理不能用于等度洗脱分离的样品。当用等度洗脱出现保留远大于20倍t0的洗脱时间时适合用梯度洗脱。本节内容是以反相梯度来进行讲述，事实上也可扩展应用到其他液相体系的梯度洗脱。
除了样品的极性范围很大时会需要使用梯度洗脱之外，上文说到分子量大的物质，例如多肽，蛋白质，核苷等物质，其保留行为对流动相的组成(%B)非常敏感，使用等度会带来重现性差的问题，梯度洗脱的重现性好，分离时间可控，效率更高。
基于公式1-1，梯度的保留可以表达为
即对于给定的溶质，梯度过程中，logk随梯度内时间t的变化而线性的变化。此关系被称为线性溶剂强度梯度（LSS, Linear-solvent-strength）。
如下图1-10所示，在进行梯度研究时，可以通过起始比例%B和结束比例%B相同但tG不同的两个梯度来预测第三个梯度下溶质分子的保留时间。
图1-10两个tG显著不同的梯度可进行梯度拟合预测其他梯度以及等度
基于施耐德提出的LSS线性溶剂强度梯度概念，梯度模拟仅需两个有差异的梯度作为输入值即可进行建模和模拟。为了降低预测的误差，建议使用简单的单阶梯度，而非中间诸多拐点的复杂梯度，目前带有曲率的非线性梯度尚未见有软件能够模拟其色谱行为。
施耐德在《现代液相色谱导论》中引入了梯度保留因子k*的概念。梯度保留因子与等度洗脱中保留因子k的概念相似。可以认为是线性梯度中间点时(如果中间点恰巧有色谱峰的话)的保留因子。图1-11列举了不同tG长度的线性梯度的梯度保留因子k*的大小分别为1.5，5，15 而其选择性显然各有不同。梯度研究实际上是对k*进行变化来优化分离。
图1-11 同一样品3分钟，10分钟，30分钟的典型色谱图和k*
k*的大小和溶质的固有属性S，实验条件tG，流速F,色谱柱死体积Vm，梯度的变化的范围（B%高低水平差）相关，公式如1-5所示。
之所以在此引入1-5公式，主要为指出梯度建模后还可以对流速进行直接预测。对流速进行高低水平变化进行建模时其本质上可以认为是对梯度进行了变化，两者不必重复。也就是说如果做两因素研究，做梯度和流速的两因素研究是没有必要的。
作为单因素，梯度本身是复杂的，即使一个简单的单阶梯度，梯度模型也可以有三种视图方式对其进行分析和评估。这三种分离度视图分别是tG时间，起始比例和结束比例。常规最先关注的是梯度时长的视图。如图2-12所示的输入梯度tG时长分别为40min和70min 梯度，起始比例和结束比例相同都是5-80%来构建梯度分离度模型。
图1-12 B相5-80% 的tG 40min和70min 梯度
图1-13到1-15分别显示梯度模型单阶梯度的三种视图方式，在各种视图方式下，都可以调整特定指标的水平，对自己感兴趣的目标进行预测。在单阶梯度不能达到目标的情况下，可以人为增加拐点。要注意的示引入一个拐点，就会增加两个变量，拐点时间和拐点的比例，其受前后点的具体数值的影响，手动调整的难度就会增加，需要在各种视图方式下进行来回的跳转和切换。
图1-13 梯度模型单阶梯度方法tG视图
图1-14 梯度模型单阶梯度方法起始比例视图
图1-15 梯度模型单阶梯度方法结束比例视图
值得注意的是，起始比例的耐用性很重要，它的耐用性可以决定是否对不同仪器的不同梯度延迟体积有兼容和耐用的能力。
以图1-12的这两个梯度时长分别为40min,70min的5-80%的梯度构建线性的梯度模型，对特定的色谱条件90min,130min, 5-80% 梯度条件进行预测，将预测谱图和实测谱图进行比对。分别如图1-16和图1-17所示。
图1-16 90min5-80% 梯度预测和实测图
图1-17 130min 5-80% 梯度预测和实测图
可以发现，很多情况下两个线性梯度建立的梯度模型可以预测更平缓的梯度，而且准确度良好。显然，必要时可以用此模型来预测各种带拐点的梯度以及等度的分离效果。
在进行梯度模拟时，需要输入流速信息。因为基于公式1-5，梯度模型可以用来预测流速的变化带来的影响。基于公式1-5，如果流速变化，又要保持k* 不变（k*不变即选择性不变），显然梯度时长tG也必须发生对应的变化。图1-18显示了流速1.0，2.0，3.0并同时设定梯度时间为70min, 35min, 23.3min时的保留情况。由于k*没有发生变化，谱图从视觉上有所变化，但物质之间的选择性或者说分离度也不会发生根本性的变化，仅是略为提高。总起来说，如果只轻微改变流速，类似于反比例改变了梯度时间，将梯度时长tG缩短或者拉长。
图1-18 流速1.0，2.0，3.0同时调整梯度为70min, 35min，23.3min的色谱图
进行梯度研究时，梯度本身并非是所设即所得的。现实的仪器都存在梯度延迟（Gradient delay）现象。梯度延迟是指梯度开始之前存在的一段等度洗脱时间，如图1-9所示。其原因是每台梯度洗脱的仪器都一定的滞留体积称为VD, 或者Dwell Volume。不同的仪器的滞留体积有所不同。一些仪器公司的仪器，比如Waters，安捷伦和热电公司的色谱仪的HPLC仪器的滞留体积通常在1ml 以下，而岛津公司的仪器会达到2ml以上。
两台仪器的VD存在差异的仪器，执行同样的梯度时可能会产生不同的分离效果，尤其时对不规则性的样品，可能会导致较早洗脱的色谱峰的选择性改变。
图 1-19滞留体积对梯度的影响
进入UHPLC时代，仪器的设计方面进步已经将梯度延迟体积压缩到很小，通常都在0.2-0.3ml之间。但由于流速和运行时间缩短，滞留体积依然会对色谱峰的保留时间有明显的影响，因此测量VD以及在色谱模拟时设定正确的VD大小，将对色谱模拟的精确度带来帮助。测试仪器的延迟体积的方法请参见其他手册。
小结
反相梯度洗脱的模拟具有非常大的实际应用价值。日常工作中，分析方法开发人员往往会以自己的思维惯性运行相当多的梯度变化来达到分离的目标。在面对复杂样品时，这些努力反而被证明是对时间和资源的浪费。掌握了反相梯度洗脱的模拟的知识和技巧，应用Lc-Simulator的模拟能力可以获得很好的时间和效率上的收益。
不同品牌的色谱仪的VD已知会有显著的不同。因此方法开发人员应该对自己方法开发的仪器的VD大小做准确的测量，在方法转移时对目标仪器也应进行测量。已知VD会对梯度敏感的物质的保留产生明显的影响从而影响分离度，忽视这一点会导致方法的重现性变差。
