用主成分分析法对市售的含苯基的反相液相色谱柱进行色谱分类和比较

含有苯基型功能的反相液相色谱(RPLC)固定相的普及和商业可用性急剧增加。在最近的一项研究中，发现39%的RPLC分析使用C18色谱柱，12%使用苯基色谱柱。与传统的C-烷基固定相相比，苯基固定相越来越受欢迎，因为它们能够与芳香溶质进行π-π相互作用，因此在方法开发策略中具有潜在的正交色谱选择性。

π-π相互作用是一种电子供体-受体相互作用，起源于两个不饱和官能团中的π-电子系统，通过分子间或分子内相互作用。在色谱系统中，这些固定相的π-电子和溶质之间可能发生相互作用。当固定相是富电子的(即软路易斯碱)而溶质是缺电子的(即软路易斯酸)时，苯基固定相的π-电子与溶质之间的相互作用(电荷转移)更有利。为了促进和利用π-π相互作用，人们制备了含有各种芳香基团的固定相-苯基、芘基、环烷基、氟烯基、蒽基和萘酰亚胺。

苯基键合相已成功用于分离位置异构体、生育酚、类黄酮、芴类、多核芳香族和硝基芳香族化合物、活性药物成分及有关物质。

美国药典将具有苯基功能的市售反相色谱柱分类为L11(定义-苯基与多孔硅胶颗粒化学键合)，目前(2006年12月)有超过70个商业固定相属于这一分类，每年都有大量新的苯基固定相被引入。苯基固定相在图1所示的示意图中进行了典型描述，其中

(i)硅胶的酸度取决于其金属含量，即传统的硅胶(如Hypersil和Spherisorb)，酸洗硅胶(如Hypersil BDS)或新一代纯硅胶(如XBridge)。

(ii)键合技术可以是单体(如ACE，R = 甲基和Zorbax SB, R =异丙基)或聚合物(如Prodigy和Ascentis, R = OH或O-Si-O)。

(iii)硅原子和苯基环之间的间隔物可以从n = 0到6变化，赋予固定相不同程度的疏水性和π-π特性。

(iv)固定相可以包含一个或两个苯基环(例如，已知Pursuit DP和Fortis固定相具有两个苯基基团)，因此可以预期这将影响固定相的芳香特性和疏水性特性。

(v)该固定相在间隔物和苯基环之间可能含有杂原子(例如，已知Synergi polar RP含有一个苯氧乙基基团)。

(vi) 固定相可以封端或不封端(如，Prodigy，Zorbax SB和Spherisorb是非封端的)或具有极性封端(例如Synergi polar RP)。

固定相的碳载量和表面覆盖率范围很广(即在本研究中，Spherisorb的最低值为2.5%和1.72μmol/m²，而Luna苯己基的最低值为17.5%和4μmol/m², Ascentis苯己基的最低值为19%和4.3μmol/m²)。

毫无疑问，上述变量将导致名义上是类似固定相，但实际却具有不同的色谱性质。

并非所有的制造商都愿意透露其商用固定相色谱柱的功能、键合技术和组成。因此，迄今为止，选择相似和不同的苯基固定相一直是一个反复试验的问题。

本文描述了使用主成分分析(PCA)的化学计量工具来评估一系列可获得的商业苯基固定相的色谱性能异同点，并将其与烷基和五氟苯基(PFP)固定相进行比较。

Tanaka色谱分类方案与新开发的测试程序一起用于区分这些固定相的芳香π-π相互作用程度和疏水特性。

图1

所使用的溶剂均为Romil(Cambridgeshire, UK)或Sigma-Aldrich(St. Louis,MO, USA)提供的HPLC级及以上。水由Milli-Q-plus185超纯水系统(Molsheim, France)提供。测试分析物和流动相化学品由Sigma-Aldrich (Poole，UK)和Fischer Scientific (Loughborough，UK)提供。Tanaka柱表征按照先前的报道进行。五种与药物相关的亲脂性分析物和具有广泛pKa和logD值范围的碱性分析物被选择用于LC研究。其中包括由Sigma-Aldrich公司提供的盐酸苯海拉明和盐酸去甲替林，以及由阿斯利康化合物库(loughborough, UK)提供的AZ化合物AZ-R12495、AZ-R12925和AZ-C69397，浓度均为0.3 mg/ml（以水为稀释剂）。亲脂碱性测试混合物由100μl苯海拉明、去甲替林、AZ-R12495、AZ-C69397、AZ-R12925和苯酚加500μl水组成。亲脂性测试混合物中化合物的结构、pKa和logD值来自文献（B. Channer, P.U. Uhl, M.R. Euerby, A.P. McKeown, G.G. Skellern, D.G. Watson, Chromatographia 61 (2005) 113.）。（校对者发现作者所引文献中的化合物名称有误，AZ-R12925可能对应AR-R12924，AZ-C69397可能对应AR-C68397）

硝基芳香烃由Sigma-Aldrich提供，由以下成分组成:2,4-二硝基甲苯(用乙腈稀释制成1000μg/ml溶液，取1 ml用MeOH稀释至5 ml)， 4-硝基甲苯(取2.8 mg用10ml MeOH稀释)， 2,3-硝基甲苯和硝基苯(各取2μl以10 ml MeOH稀释)， 1,3,5-三硝基苯(用乙腈稀释制成1000μg/ml溶液，取1 ml用MeOH稀释至5 ml)。将每种分析物溶液100μl混合在一起，用MeOH稀释得到含有每种分析物33μg/ml的硝基芳香族测试混合物。六甲基二氮杂烷、冰醋酸和试剂级咪唑购自Sigma-Aldrich公司。所有苯基硅烷均购自Gelest (Philadelphia, PA，USA)。

HPLC分离在Agilent Technologies 1100型液相色谱仪上进行，使用ChemStation 9.03版色谱软件(Agilent Technologies, chadle, UK)，配备Agilent色谱柱和溶剂切换阀。

在开始测试之前，至少用20倍柱体积的流动相对色谱柱适当冲洗。所有色谱柱，如有可能，均为制造商或供应商提供的新色谱柱。色谱柱的特征在本研究中如表1所示。制造商评估的苯基固定相详尽参数如表2所示。流动相使用四元梯度泵和容积为1ml的在线脱气器在线脱气。流速和进样量根据柱尺寸进行调整(如，150mm ×4.6 mm柱的流速为1.0 ml/min)。在所有的测试中，分析物通常在30分钟内洗脱。样品溶剂进样的第一次基线波动被用作死时间标记。

用于HPLC固定相表征的Tanaka色谱条件如下，有关测试的完整描述见参考文献。

表1

表2

2.3.1. 戊基苯的保留因子，k_PB

色谱条件: MeOH-H₂O (8:2, v/v)，40℃，进样5μl (戊苯0.6 μg/ml)。

2.3.2. 疏水或疏水选择性，α_CH2

色谱条件: MeOH-H₂O (8:2, v/v)，40℃，分别进样5μl (戊苯0.6 μg/ml、丁基苯0.3 μg/ml)。

2.3.3. 形状选择性，α_T/O

色谱条件: 流动相同“疏水选择性”项下，分别进样5μl (苯并菲、邻三联苯均0.05 mg/ml)。

2.3.4. 氢键能力，α_C/P

色谱条件: MeOH-H₂O (3:7, v/v)，40℃，分别进样5μl（苯酚1mg /m、咖啡因0.5 mg/ml)。

2.3.5. 总离子交换能力，pH 7.6下的α_B/P

色谱条件: MeOH-H₂O (3:7,v/v,含20mMKH₂PO₄，pH7.6)，40℃，分别进样5μl（苯酚和盐酸苄胺浓度均为0.5 mg/ml）。

2.3.6. 酸性离子交换能力，pH2.7下的α_B/P

色谱条件:与上述总离子交换能力测定条件相同，但使用pH 2.7的KH₂PO₄缓冲液。

2.3.7. 硝基芳香化合物探针

色谱条件: MeOH-H₂O (1:1,v/v)，40℃，进样5μl硝基芳香族测试混合物，在254 nm处检测。

2.3.8. 亲脂碱性分析物

色谱条件: MeOH-H₂O (45.5:54.5, v/v, 含20mMKH₂PO₄，pH2.7)， 60℃, 进样体积5μl（亲脂碱性性测试混合溶液，在210 nm处检测）。

下面简要介绍了表征过程中使用的不同色谱参数。

分子结构和性质原文中没有，校对者提供

2.4.1. 正戊基苯保留因子，k_PB

反映固定相的表面积和表面覆盖率(配体密度)。

2.4.2. 疏水或疏水选择性，α_CH2

正戊苯(PB)与正丁基苯(BB)的保留因子比，aCH2=k_PBB/kBB。因为由一个甲基分化的烷基苯之间的选择性取决于配体密度。

2.4.3. 形状选择性，α_T/O

苯并菲（T）和邻三联苯（O）之间的保留因子比，aT/O=kT/kO。这是对形状选择性的度量，它受配基间距的影响，也有可能受硅烷键合基团的形状和功能的影响。

2.4.4. 氢键能力，aC/P

咖啡因（C）与苯酚（P）的保留因子比，a_C/P=k_C/k_P。这是对可用硅羟基数量和封端程度的度量。

2.4.5.总离子交换能力，pH7.6下的aB/P

苄胺（B）与苯酚（P）的保留因子比，a_B/P pH7.6=k_B/kP。这是对总硅烷醇活性的度量。

2.4.6. 酸性离子交换能力，pH 2.7下的α_B/P

苄胺（B）与苯酚（P）的保留因子比，aB/P pH 2.7=kB/kP。这是衡量硅烷醇基团酸性活性的指标。

2.4.7. 芳香选择性(苯基固定相的π-酸度)，αPB/O

正戊苯(PB)与邻三联苯（O）的保留因子比，αPB/O=k_PB/kO。这被认为是衡量芳香族选择性的指标，芳香族选择性受固定相上芳香族特征密度的影响。

2.4.8. 芳香选择性(苯基的π-碱度)，α_{TNB/ NB}，α_{DNT/ NB}，α_{TNB/ DNT}

1,3,5-三硝基苯(TNB)和硝基苯(NB)的保留因子比，α_TNB/NB=k_TNB/k_NB，2,4-二硝基甲苯(DNT)和硝基苯(NB)，α_DNT/_NB=k_DNT/k_NB，1,3,5-三硝基苯(TNB)和2,4-二硝基甲苯(DNT)的保留因子比，α_TNB/_DNT=k_TNB/k_DNT。这些参数被认为是表征芳香族选择性的指标，芳香族选择性受固定相上芳香族特征密度的影响。

2.5.1. 主成分分析

采用Simca-P 8软件(Umetrics, Umea, Sweden)进行主成分分析。表征色谱柱选择性差异的六个变量都被纳入分析。为了给予所有变量相同的权重，这些变量是“消除量纲”的，即：每个变量与该变量平均值的差值，除以其标准差。

2.5.2. logD和logP预测

使用Advanced Chemistry Development软件程序版本8.08 (Toronto, Canada)用于pKa和log P的预测。

2.6.1. 苯烷基固定相(I-IV)

210 ml甲苯和30 g二氧化硅的混合物在氮气条件下115℃共沸，冷却至室温。冷却后，加入2.00 g水和6.06 g咪唑。将混合物留在室温下搅拌1小时，加入对应的苯烷基(二甲基)氯硅烷[Ph(CH₂)nSi(CH₃)₂Cl，n = 0、2、4、6;0.11 mol]，室温搅拌。反应持续16 h，然后将混合物加热至100℃ 4 h，冷却至室温。然后用200 ml甲苯、200 ml甲醇、200 ml 50:50 (v/v)甲醇/水、200 ml甲醇洗涤，然后在60℃的烘箱中用氮气流烘干24 h。为了封端固定相，将二氧化硅悬浮在240 ml甲苯中，并加入22.65 g六甲基二氮杂烷。将混合物加热至100℃ 16 h，然后冷却至室温。用200 ml甲苯、200 ml甲醇洗涤二氧化硅，在60℃氮气流烘箱中干燥24 h。

2.6.2. 苯氧丙基A相

210 ml甲苯和30 g二氧化硅的混合物在氮气条件下115℃共沸，冷却至室温。冷却后，加入2.48 g水和6.06 g咪唑，在室温下搅拌1小时，在室温下搅拌加入3-苯氧丙基三氯硅烷(0.11 mol, 30.02 g)。继续反应16 h，将混合物加热至100℃ 4 h后冷却至室温。用200 ml甲苯、200 ml甲醇、200 ml 50:50 (v/v)甲醇/水、200 ml甲醇洗涤，然后在60℃的烘箱中用氮气流干燥24 h。为了封端固定相，将二氧化硅悬浮在240 ml甲苯中，并加入22.65 g六甲基二硅烷。将混合物加热至100℃ 16 h，然后冷却至室温。用200 ml甲苯、200 ml甲醇洗涤二氧化硅，在60℃氮气流烘箱中干燥24 h。

2.6.3. 苯氨基丙基 B相

除0.25 g冰醋酸代替咪唑，3-苯基氨基丙基三甲基氧基硅烷(0.1058 mol, 28.43 g)代替3-苯氧基丙基三氯硅烷外，采用了与A相相同的方法。将混合物加热至70℃76 h，然后冷却至室温。

2.6.4. 苯丁基C相

除用3-苯基丁基三氯硅烷(0.11 mol, 29.80 g)代替3-苯氧丙基三氯硅烷外，采用了与A相相同的方法。

与标准C18色谱柱相比，针对对苯基柱的物理和色谱的表征和对比研究有限。Snyder等人报道，苯基固定相具有比C18固定相更高的极性和比C8固定相更低的疏水性;与B型C8固定相（3.7μmol/m²）相比，苯基固定相(2.7μmol/m²）具有更低的形状选择性，这可能和苯基固定相低的配体浓度有关;苯基固定相的氢键能力较低，可能是由于苯基与表面硅烷醇的相互作用和在pH值为2.8和7.0的离子交换能力较高。Tanaka等人在一项研究中比较了各种溶质在不同尺寸、刚性和不饱和程度的固定相上的保留率，观察到芳香和极性化合物在芳香色谱柱上的保留强于烷基固定相，而对饱和烃的保留率低于固定相。

本文描述的色谱柱表征方案基于Tanaka的成熟方案，表征了固定相的疏水性、形状选择性、氢键能力和在pH 2.7和7.6下的离子交换能力。为了评估这些固定相的芳香选择性，我们使用了Lindner和Horak提出的方法(π-固定相的酸度)，并将其与新开发的使用硝基苯衍生物的程序(π-固定相的碱度)进行了比较。这些测试已应用于21种市售苯基固定相、20种烷基固定相和3种PFP固定相的表征(见表1-3)。在可能的情况下，在研究中采用了连接到相同碱性硅胶基质的苯基固定相和相应的烷基固定相。

表3

3.2.1. 硝基苯测定芳香族选择性的基本原理

在Tanaka试验条件下，硝基苯在MeOH/水(50:50,v/v)中的保留系数与戊基苯在MeOH/水（80:20,v/v)中的保留系数相关(见3.4.2)，这表明单取代的硝基苯溶质(低π-酸度)反映了固定相(π-碱度)的疏水保留系数，并表现出很少的π-π相互作用。甲醇被用作流动相有机改性剂，因为与乙腈和四氢呋喃相比，甲醇增强了苯基固定相的芳香选择性。

我们认为具有较大硝基取代度的苯衍生物(即TNB和DNT)是更强的π-酸，因为多个硝基将电子从芳香环上吸走，使环电子缺乏(π-溶质的活性TNB > DNT > NTs和NB)。因此，预计TNB和DNT将表现出从富电子苯基固定相(π-碱)向缺电子溶质的电子电荷转移增强，从而产生NB < NTs < DNT < TNB的预期洗脱顺序。TNB和DNT相对于硝基苯和硝基甲苯异构体(α_TNB/NB, α_DNT/NB 和α_TNB/DNT)的选择性因子理论上应该是一个很好的芳香选择性指标。

3.3.1.正戊苯(PB)与邻三联苯（O）的选择性因子αPB/O作为芳香相互作用的指标

Lindner和Horak先前提出，Tanaka测试溶质，正戊苯/邻三联苯(PB/O)的比例，可能提供了固定相与芳香溶质发生芳香相互作用的能力的指示。在我们的研究中，所有的C18相对正戊苯/邻三联苯(α_PB/O/O)的选择性因子都>1(即邻三联苯先于戊苯洗脱)。相反，对于苯基固定相，随着π-π相互作用的优势增加，α_PB/O<1(即，由于其假定的芳香性增加，邻三联苯比戊苯保留的时间更长)。然而，一些苯基己基固定相是例外，因此α_PB/O项可能归因于多个保留过程。

3.3.2. 硝基芳香探针作为芳香相互作用的指示物

硝基芳香溶质在C18和C8相上的洗脱顺序(见图2b和d)反映了溶质logP值[TNB (logP = 1.22) < NB (logP = 1.95) < DNT (logP = 2.08) < 2-NT、4-NT和3-NT (logP = 2.41)]。

（校对者以AutoChrom pH selector 对TNB,NB,DNT,NTs的logD作图如下）

这表明硝基芳烃溶质在C-烷基固定相上的疏水保留机制占主导地位。C-烷基固定相的选择性因子α_TNB/NB、α_DNT/NB和α_TNB/DNT分别为典型的0.6-0.7、1.5-1.6和0.4-0.5(见表3)，而苯基固定相则产生了典型的NB < 2-NT、4-NT和3-NT < TNB < DNT的洗脱顺序，这突出显示除疏水相互作用外，对π-π保留机制的强烈依赖(见图2a和c)。然而，从表3可以看出，αTNB/NB的差异很大。αDNT/NB和αTNB/DNT值突出表明它们在π-π相互作用中具有很大的差异，这可能归因于它们的成键化学差异，特别是连接苯基部分和硅原子的烷基链的差异。

与苯基固定相(即路易斯碱，富电子)相比，五氟苯基固定相是强路易斯酸(即缺电子)，在c -烷基和c -苯基固定相之间表现出中间洗脱顺序(TNB < NB < 2-NT, 4-NT < DNT < 3-NT)，产生典型的选择因子α_TNB/NB、α_DNT/NB和α_TNB/DNT分别为0.6-0.8,2.0-2.2和0.3-0.4。Synder等人先前提出，与苯基和五氟苯基固定相相关的精确保留机制(即π-π相互作用、色散相互作用和溶质与固定相之间的偶极相互作用的差异)很难从它们的疏水性中提取出来。从本研究获得的结果来看，苯基固定相和PFP相之间主要的保留机制似乎存在差异，并且这两种固定相之间的作用机制应作为通用固定相筛选计划的一部分进行评估。

图2

3.3.3. 将电负性原子加入苯基固定相间隔物对芳香族选择性的影响

与苯基环相邻的氧原子结合，如在Synergi Polar RP相中，由于共轭效应会引起电子释放进入苯基环，导致苯基环更富电子，并增加其π-碱度，导致更大的π-π相互作用。π-碱度的顺序应与苯基环上的Hammett常数的顺序相同，即氨基>醚>氢取代基 。为了证实这一点，将一系列具有不同(CH₂CH₂CH₂X)间隔(X = CH₂，O或NH)的实验单官能苯硅烷被键合到相同的碱性硅胶上。α_TNB/NB、α_DNT/NB和α_TNB/DNT选择性因子的大小支持了所提出的保留机制，芳香族的选择性以X = CH₂< O < NH的顺序增加(见表4)，证实了苄胺相表现出最大的π-π相互作用。

表4

3.3.4. 苯基固定相中烷基间隔物长度对芳香族选择性的影响

为了研究硅原子和苯基环之间的烷基间隔物对苯基固定相芳香选择性的影响，我们使用相同的键合化学方法将一系列具有不同(CH2)n间隔物(n = 0、2、4和6)的实验单官能团硅烷键合到相同的碱性硅胶上，并使用我们的硝基芳香探针进行了检测。直接连接到二氧化硅表面的苯基环被发现具有较低的芳香选择性(即αTNB/NB低于1，αDNT/NB约为1.5)。发现芳香选择性随着间隔物长度的增加而增加(见图3)。当苯基环靠近二氧化硅表面时，分析物无法接触到π-π相互作用(即它们可能在自己之间表现出π-π堆叠)。相反，具有增加间隔链长度的苯基固定相更灵活，因此苯基环可能更容易接触到溶质的芳香基团，这应该导致π-π相互作用的更大概率。

这些发现得到了商业苯基固定相的支持，因为苯基己基相(例如Luna苯基己基，见图2c)的选择性值αTNB/NB和αDNT/NB分别约为2.0和2.5，而拥有乙基间隔物的Prodigy苯基(见图2f)的选择性因子介于含有(CH2)n间隔物的相之间n = 0和6。较长的间隔物可能提供更好的色谱柱稳定性以及增强的芳香选择性。

图3

21个苯基固定相、3个PFP相、19 个C18相和1个C8相的柱表征程序结果见表3。Tanaka柱表征的初步结果表明，Spherisorb苯基固定相(柱16)是一个异常值，表现出极低的疏水保留和高硅烷醇活性(结果未显示)。这与制造商声称只有2.5%碳载量的数据是一致的，该色谱柱没有封端，并且它是一个酸性a型硅胶基质的相对古老的固定相。

3.4.1. PC1-PC2得分图

采用Tanaka和芳香选择性方案(不包括Spherisorb苯基固定相)的所有色谱柱的PC1-PC2模型描述了超过73%的色谱变异性。PC1-PC2得分图(图4a)总结了特征色谱柱之间的异同。对分数图不同象限的化学意义的简化描述是，位于右上象限的色谱柱比平均色谱柱显示出更明显的形状选择性，右下象限的柱显示出更大的疏水性和表面覆盖率，左下象限的色谱柱显示出更多的芳香烃相互作用，左上象限的色谱柱更多的硅烷醇相互作用。下面给出了对异同点的详细描述。

PC1-PC2得分图突出表明，这些固定相可以分为不同的亚组(见图4a)。

(i)包含所有C18相的组(C组)。

(ii)苯基固定相被证明是一组非常不均匀的相(见a组)，然而，许多苯基固定相表现出与实验相相似的性质(即与疏水相互作用相比，芳香相互作用较低-选择性因子αTNB/NB,αDNT/NB和αTNB/DNT分别约为0.9,1.5和0.6)，其中苯环直接键合到二氧化硅表面(见第3.3.4节和图3，实验固定相I, n = 0)，在a组内形成紧密的组(B组)，该组还包含Pursuit (柱15)和Fortis (柱6)苯基固定相，已知其性质为二苯基(即1,1-二苯基甲烷)，然而，制造商没有提供有关其烷基间隔物长度的信息。除了疏水参数k_PB外，这些二苯基固定相的色谱特征非常相似，这表明它们唯一的区别可能在于所使用的间隔物的长度，即Fortis相可能具有更长的烷基链，因为它更疏水。表现出低芳香相互作用的1,1-二苯基甲烷可能掩盖了它下面的烷基间隔物的作用。基团中的其他相(即3、4和14号，BDS Hypersil苯基，BetaBasic苯基，Prodigy苯基)的固定相覆盖率低，碳载量低，芳香性差，其αTNB/NB,αDNT/NB和αTNB/DNT的选择性因子表明这些是具有短烷基间隔或没有烷基间隔的苯基固定相。这一结果进一步被这样一个事实支持，即在实验相中，苯基直接或通过短间隔物与二氧化硅键合表现出类似的选择性(见图2e和图3)。

(iii)Hypersil苯基(柱8)及其ODS类似物(柱30)分别是A/B组和C组的异常值，因为它们具有高离子交换活性(见图4b)。

(iv) ACE Aq和HyPURITY C8 (柱22和32)的色谱性质介于C18相和苯基固定相之间，位于含有五氟苯基固定相的D组内。

(v)苯基己基类相似乎有很大的多样性-Betasil苯基己基(柱5)，表现有点像苯基短间隔物相，但仍然保持良好的疏水性，这表明可能使用了双官能硅化试剂。相比Gemini苯基己基(柱7)和Nucleodur Sphinx (柱13，这是一个混合苯基/烷基)相，Luna苯基己基(柱11)似乎更类似于XBridge phenyl(柱18)。

 (vi) Ascentis苯基、Luna苯基己基和XBridge苯基固定相(柱2、11和18)被认为是聚合相(即三官能)，并具有延伸的烷基间隔层(C4–C6)可以位于A组的底部。

(vii)大多数苯基固定相具有与HyPURITYC8相（柱32）相似的疏水性。

(viii)三个PFP相(柱27、28和40)紧密地聚集在D组中，与苯基固定相(约1)相比，它们的α_T/O值高(约2.5)，而C18相的α_T/O通常约1.5，因此易于区分。这一现象的确切原理尚不清楚，这表明其中涉及多种保留机制。

(ix)与相应的C18相(即柱 1，ACE phenyl= 1.14；柱23， ACE C18 = 0.40)相比，苯基固定相似乎具有更大的α_C/P值。参见3.4.3节的解释。

图4

3.4.2. PC1-PC2载荷图

载荷图(见图4b)证实了Tanaka参数–α_CH2和k_PB与硝基甲苯和硝基苯三种异构体之间的α参数之间的正相关关系，突出了所评估的疏水性参数的冗余。芳香选择性参数α_TNB/NB、α_DNT/NB和α_TNB/DNT呈正相关，但与Lindner芳香选择性参数αPB/O没有良好的0◦或180◦相关性。不出所料，离子交换参数之间存在松散的相关关系。

一系列实验单功能硅烷(相同碱性硅胶，封端和键合化学)在二氧化硅表面和苯基部分之间具有不同的 (CH₂)n 间隔物(n = 0,2,4和6，图3中的I-IV相)，其芳香选择性参数α_TNB/NB和α_DNT/NB被证明是相关的(R2= 0.9991，结果未显示)，因此这些参数中存在冗余。

3.4.3. 贡献图

ACE C18 (柱23) 与其对应的ACE苯基(柱1)对比的PCA贡献图(见图5a)，强调基于相同碱基硅胶基质的其他C18相与苯基固定相的总体趋势。与相应的苯基固定相相比，C18相表现出更多的疏水保留(k_PB、α_CH2、α_{硝基甲苯/NB}增加)、低氢键(α_C/P减少)和低芳香相互作用(即即α_TNB/NB、α_DNT/NB和α_TNB/DNT低，且α_PB/O高，见第3.3.1节)。与苯基固定相相关的较高的氢键参数与Synder等人的观察结果相反[14,28]。由于已知咖啡因通过π-π相互作用与芳香族化合物作用，除了任何氢键作用外，咖啡因在苯基固定相上的增强保留可能归因于芳香咖啡因与苯基固定相之间的π-π相互作用。α_C/P值与芳香族相互作用参数无关(见图4b)，因此可以得出结论，咖啡因的增强保留是由于芳香族和氢键机制。因此，咖啡因不是评估苯基固定相氢键能力的合适探针，这使得它在苯基固定相表征中的应用值得怀疑。Snyder等人所描述的脂肪族探针应该更合适。

一般来说，具有己基间隔物(即Luna苯基己基，柱11)的苯基固定相的PC1贡献图(见图5b)与那些具有小烷基间隔物(即(CH₂)n，其中n = 0-2，或二苯基部分，即Pursuit diphenyl，柱15)的相相比，显示出增加的疏水保留(增加k_PB，αCH₂、α_{硝基甲苯/NB}增加)，增加的形状选择性项(增加α_T/O和α_PB/O项)和增加的芳香相互作用项（α_TNB/NB、α_DNT/NB和α_TNB/DNT）。有趣的是，所提出的芳香族相互作用项α_PB/O与α_T/O项的相关性比α_TNB/NB、α_DNT/NB和α_TNB/DNT参数的相关性更强，这表明α_PB/O项并不是单独描述芳香族保留机理的，即α_PB/O参数比芳香族选择性更适合用于表征形状选择性。

Pursuit diphenyl (来自B组的柱15)，和Ascentis phenyl (即(CH₂)4链间隔物，来自A组的柱2)与典型的五氟苯相(即Pursuit PFP，来自D组的柱40)对比的PC1贡献图，分别可以在图5c和d中看到。图中突出了这样一个事实，即PFP相通常比短链间隔物具有更多的疏水保留，而比中间链间隔物更少。与所有苯基固定相相比，它们具有增强的形状选择性，与中间链间隔物相比，它们具有较低的芳香保留，但大于二苯基固定相。

图5

苯基固定相的主成分分析突出了这类L11相的极端多样性。从这些结果来看，非常清楚的是，目前药典采用的简单分类程序是不够的。化学计量学对色谱分类的有用性体现在能够很容易的识别出具有相似和不同色谱性质的苯基固定相。

PC1-PC2得分图(图4a)清楚地显示，BetaBasic phenyl (柱4) 和Pursuit diphenyl (柱15)应分别产生相似的色谱。这在使用甲醇作为流动相有机改性剂对一系列与药物相关的亲脂碱的色谱分析中得到了证实(见图6)。BetaBasic phenyl (α _9/7 = 1.15，α_10/9= 1.23和α_11/10= 1.75) 和Pursuit diphenyl (α _9/7 = 1.14，α_10/9= 1.28，α_11/10= 1.65)对于亲脂碱的选择因子非常相似。

图6

在正交选择性的苯基固定相选择方面，PC1-PC2得分图(见图4a)表明，Pursuit diphenyl (柱15)， Gemini苯基己基(柱7)、Luna苯己基(柱11)和Synergi Polar RP (柱17)应产生不同的色谱选择性。这些固定相与Gemini固定相的PC1贡献图(见图7a-c)突出表明:

(i) Luna色谱柱(见图7a)具有类似的疏水保留，增加了明显的氢键作用(这可能归因于增强的芳香保留力，见第3.4.3节)和增加的芳香保留力。

(ii) Pursuit 色谱柱(见图7b)具有较低的疏水保留力和降低的芳香保留力。

(iii)Synergi Polar RP(见图7c)具有较低的疏水保留，增加了明显的氢键作用(这可能归因于增强的芳香保留力，见第3.4.3节)，并且由于苯基环附近存在供电子氧原子而具有较高的芳香保留。

它们的正交色谱选择性在使用甲醇作为流动相改性剂对药物相关的亲脂性碱的等度分析中得到了证实(见图8)。

图7

图8

另一种确定固定相相似或不相似程度的方法是使用评估色谱参数的加权因子计算目标色谱柱与数据库中其他色谱柱之间的八维变量空间中的距离。这可以通过以下电子表格程序(例如微软Excel)实现:

(i)所有变量均通过减去该变量的平均值并除以其标准差来 “消除量纲”。

(ii)计算目标色谱柱与数据库中所有其他色谱柱的“消除量纲”变量之间的差值。

(iii)利用这些差异，通过毕达哥拉斯定理计算目标的色谱柱与其他色谱柱之间的距离。

(iv)通过对这些距离进行排序或排序，就有可能识别出数据库中最相似或最不相似的色谱柱。参见图9的Excel电子表格的示例，用于找到Pursuit diphenyl（柱15）的等效柱。可以观察到，与Pursuit diphenyl（柱15）最相似的固定相是Betabasic phenyl（柱4）。(这与PCA得到的结果相同，见图4a)。

等效色谱柱间的距离值应尽可能低(比如，Pursuit diphenyl与Betabasic phenyl之间的距离值[Δ]等于0.4，见图6)。相反，高值，如图8所示(即Δ> 1.5)突出了苯基固定相之间显著的色谱选择性差异。

图9

如今，相关的色谱柱的信息已经录入ACD的AutoChrom软件包内，可以方便的比较和选择。如下图。（校对者）

本文描述了21个苯基固定相(USP L11分类柱)的表征，使用已建立的和新的测试方案来评估疏水性，氢键作用力，离子交换能力和它们的芳香相互作用程度。将苯基固定相与其相应的C-烷基固定相和五氟苯基固定相进行了比较。用PCA对色谱柱及其生成的色谱参数进行了分析，以便:(1)确定等效色谱柱;(2)筛选选择性差异较大的苯基色谱柱，充分利用选择性差异进行方法开发;(3)协助合理选择合适的固定相;(4)提供对保留机制的更好理解，并允许对制造商所使用的官能团和键合化学物质进行合理的推断。后者是最可取的，因为关于大多数苯基固定相性质的可靠数据很少。二氧化硅和苯基之间的烷基间隔物的长度以及苯基环相邻的电负性原子的掺入，极大影响了苯基与芳香溶质发生芳香相互作用的能力。PCA表明，第一和第二PC可以描述44个固定相色谱变异性的73%以上。PC得分图显示，苯基固定相(即USP分类L11)是一个非常异质性的固定相组，一个苯基固定相被另一个苯基固定相取代将涉及高度的风险。在大量的苯基固定相中，PCA能够识别出一个子亚组，这些亚组在二氧化硅和苯基环之间具有较小的间隔链。苯基固定相(π-碱)和五氟苯基固定相(π-酸)的色谱选择性的主要区别在于后者的形状选择性增强，芳香选择性参数降低。已知的苯基己基相在色谱性质上似乎有很大的不同。苯基固定相的疏水保留率低于相应的C18固定相。一般来说，苯基固定相似乎比C-烷基固定相具有更高的氢键能力，然而，这可能是误导，因为氢键探针咖啡因可能同时被芳香和氢键机制保留。通常，具有较长烷基连接链的苯基固定相，如苯基己基相，表现出增强的疏水性，增加的形状和芳香选择性，减少的离子交换和明显增加的氢键容作用(见上文的解释)。载荷图强调了许多探针彼此相关的事实，因此，建议除了标准Tanaka方法外，通过确定α_TNB/NB参数来评估固定相的芳香选择性，并建议用更合适的氢键探针代替咖啡因。PCA的化学计量学工具在鉴别具有非常相似色谱性质和正交性质的相似“备用”苯基固定相方面非常有用，可用于方法开发策略。