色谱模拟的基础知识
第五节 pH的模拟
AutoChrom指南：背景知识
目录
第一章 色谱模拟的基础知识
第五节 pH的模拟
第六节 正相洗脱强度模拟
当溶质分子带有可电离基团时，可电离基团在特定的pH下会发生完全电离或者部分电离，溶质分子的反相色谱保留行为会发生巨大的变化。图1-34显示了酸性化合物A和碱性化合物B的保留从pH4变化到pH10时的情况。
图1-34 典型的酸性化合物和碱性化合物的保留时间随pH变化而变化
显然，在进行分析方法开发时有必要了解清楚目标物质所带的电荷的性质和数量。这里提到的性质指的是带正电或者是负电，亦或者正负电荷都具备。而数量则可能是整数或者小数或者是0。同一个溶质在不同的pH下物质上的基团的电离程度可能各不相同，一旦复杂起来，的确是挺复杂的。
因此需要对目标物质有一个宏观的认识，从主要矛盾出发，即使物质的电离性能很不相同，首先去找到物质的最强的酸性电离点和最强的碱性电离点，识别其pKa的大小，如果酸碱基团都具备那么把两者都找到。
pKa的定义公式：
对于酸性化合物[HA] 代表酸的分子形态的浓度，[A-]代表酸的离子形态的浓度。对于碱来说[B]代表游离的分子态碱的浓度，[BH+]代表获得质子后的碱的浓度。
举例来说，如果是弱碱，pKa范围在4-6之间，强碱的pKa在10左右。这一点应和pKb的定义进行区分，避免混淆。
流动相里如果含有有机溶剂，相对于水来说物质的pKa会发生变化，温度变化pKa也会发生变化，因此物质的电离性受外界环境干扰因素是较多的。
表1-6 列举了水杨酸，苯巴比妥，非那西汀，烟碱以及甲基苯丙胺五个药物分子的pKa。水杨酸有两个酸性pKa，一强一弱，羧基的pKa为3而酚羟基的pKa为13.3。苯巴比妥的pKa是7.5，已经属于偏弱的酸了。非那西汀是被当作中性分子来举例的，其酸性pKa为13.64而碱性pKa为2.2，无论酸碱电离性能都很弱，因此被当作中性分子是很合理的，其电离基团是酰胺，其即可以获得质子也可以获得质子，但失去和获得质子的能力都很弱而已。烟碱被定义为一个略弱的碱，事实上碱性pKa 8.3还算是中等强度的有机碱，其结构上还存在一个弱碱性基团吡啶碱，pKa为3.2，如果是单独的吡啶，其pKa会高于3.2较多，但在烟碱的化学环境中吡啶基团受叔胺的影响，碱性被抑制降低了，因此其数值较小。甲基苯丙胺的pKa为10.3， 是典型的强碱性化合物。表1-6所示化合物的pKa都由ACD/Labs Percepta Physchem Suite软件进行预测而得。从预测精度来说，ACD/Labs Percepta Physchem Suite的预测属于行业金标准。
以ACD Percepta Physchem Suite v2023 预测
表1-6 化合物水杨酸，苯巴比妥，非那西汀，烟碱以及甲基苯丙胺的pKa
表1-6所示的5个代表性的药物分子在pH 3-9的范围之内做过保留时间的研究，如图1-35所示。将这些物质的保留时间拟合成曲线再和pH条件做图，得到图1-36图形。
图1-35 水杨酸，苯巴比妥，非那西汀，烟碱以及甲基苯丙胺在pH 3， 5，7，9的保留行为，C18色谱柱，40%甲醇等度，磷酸缓冲盐，流速2.0ml/min
图1-36 水杨酸，苯巴比妥，非那西汀，烟碱以及甲基苯丙胺C18色谱柱上保留行为的拟合
图1-37 水杨酸，苯巴比妥，非那西汀，烟碱以及甲基苯丙胺的logD-pH 作图
以ACD/Labs的pH-logD软件做此5个化合物的图形用来和图1-36的结果分别进行比较，可以看到很高的相似度。强酸水杨酸的图形，弱酸苯巴比妥的图形几乎完全一致，中性分子非那西汀的logD为直线，而保留行为随pH的增大实际上略有下降，猜测其原因是随着pH的增高，色谱柱上的硅醇基逐渐从中性开始电离变为带负电荷，能与非那西汀产生氢键作用硅醇基减少了，因此非那西汀的实际保留减弱，烟碱和甲基苯丙胺的保留图形和预测的logD的图形也很接近，烟碱的低pH下的logD突然降低和第二碱性pKa是有关系的。
基于图1-36和图1-37的比较，说明logD本身已经包含了pKa的信息在内，因此在进行色谱工作之初，对pH-logD做图进行分析就很有必要。
由于pH对保留的影响明显存在非线性，即使保留时间取对数，其拟合也不可能用线性方式来完成，因此最常用的函数是logk=a+bx+cx2。要注意的是，如果pH的范围如果比较宽，比如取pH 2，7，9进行实验，并进行色谱的pH模拟时容易出现预测和实测不匹配的情况，原因是取点过少，模型不够精确。大跨度的pH研究最好被视为筛选，筛选以择优为工作策略，择优之后再进行优化，来确保pH的选择性和耐用性得到和谐统一。
以下是一个pH不耐用的案例，用pH 2.2，2.5，2.8的数据，以logk=a+bx+cx2为拟合函数获得来构建所有色谱峰的保留模型，对最小分离度与pH的关系进行作图，可见虽然pH2.5 虽然有良好的测试结果，但其耐用性堪忧，如图1-38所示：
图1-38 用pH 2.8，2.5，2.2的数据，获得pH分离度图，黑圈标处标记pH2.5附近分离度为0的点
解决此类问题的常见思路是梯度-pH 两因素的响应面模型研究。第二章内容中会加以介绍。关于pKa和logD计算和模拟的更多的知识在第四章中再深入讨论。
