花非花 雾非雾

杭州泽邦

谭艳云

笑口常开，好彩自然来！虽然其貌不扬，但我还是会经常对着镜子笑，你也会这样吗？

镜子里那个冲着你笑的“镜面人”真的是你自己吗？你往左她往右，你举左手，她举右手，你和她永远不可能重叠，但是外形上一模一样。

这种“不可重叠互成镜像的关系”在化学范畴被称为“手性”，因为有手性存在就不可能有对称面，对称轴或对称中心，所以“手性”也叫“不对称性”。这里提一下物质构成的几个概念，从最小的单元，不同原子可以构成不同的分子，相同的分子式我们可以构造成不同的异构体，如图1。同分异构体又可以分为位置异构体（或称构造异构体），指的是原子间或官能团连接的顺序不同；立体异构体（或称旋光异构体），指的是原子或官能团连接的顺序相同，但它们所处的空间位置，即空间排布和取向不同。在立体异构体中，又细分为对映异构体也叫手性异构体，这里要特别强调，回到我们手性的概念，指的是不对称性，互为镜像的关系。严格来说，手性异构体指的就是对映异构体，互为镜像的异构体。不互为镜像的能重叠或部分能重叠的旋光异构体，称为非对映异构体，例如有2个手性中心，为RS(SR)与RR和SS互为非对映异构体（差向异构体），RS与SR互为对映异构体（手性异构体），同理，RR和SS互为对映异构体。

多数人可能都会将有多个手性中心弄错，不能正确定义对映异构体和非对映异构体，下面的故事会具体讲这认知不同所带来的实际体验。

图1 物质的异构情况归类

我们的地球就是一个巨大的手性池，天然存在很多手性不对称物体，如天然氨基酸都是S型（或称L型），天然糖都是D型，你是否可能会问，与上文提到的RS的手性碳标记方式，这里提到的LD手性标记又有什么差异，怎么会有两种记法？其实这两种手性标记法，就是我们化学领域中常提到的“绝对构型”和“相对构型”的2种标记方式。有两种方式和我们对真理的认知水平和当时设备的检测条件（检测技术）有关。十九世纪末期，化学家们意外发现，所得到的甘油醛能使偏振光朝不同的方向偏转，但是当时并没有如单晶衍射这样能准确检测这两种甘油醛手性碳原子的绝对构型的实验条件，化学家们人为地将能使偏振光往右偏转的甘油醛称为D型-甘油醛，符号标记为(+)；而将能使偏振光往左偏转的甘油醛称为L型-甘油醛，符号标记为(-)，此后将这个人为规定的经验广泛的应用在含一个手性中心的物质，如天然氨基酸，天然单糖类，将这种以甘油醛构型为参考物进行比对命名的手性碳命名方式，称为相对构型，记为D/L构型。巧合的是，在1951年用单晶X射线衍射对甘油醛的构型进行确认，右旋甘油醛确实为D-型甘油醛（即R构型），L-型甘油醛（即S构型）与当初的猜测恰好吻合，如图2。而RS标记是绝对构型标记法，是展现取代基团实际的空间取向，将取代基团按基团大小顺序排列，按顺序规则标记为RS构型，即绝对构型是一种规则，能真实反应手性碳的空间排布，而相对构型是参考甘油醛命名，有参照物命名的人为规定。但是随着研究的深入，所遇上的情况更加复杂，有多个手性碳甚至没有手性碳有手性轴等手性分子的出现，用甘油醛参比的相对构型的DL命名法就显得很局限了，且随着检测手段的提升和进步，如核磁NOE，圆二色谱，单晶，旋光光谱等技术的广泛应用，也能测得某个时段，某个构象相对的真实的空间排布，但由于结构复杂，也并不能再单一参考甘油醛构型的DL经验命名方式命名，因此用RS也广义的表示相对构型的标记，在标记上对于复杂分子的绝对构型和相对构型标记也云里雾里没有明显的边界了，要判断这个RS标记是否能反应基团空间的真实排布，需要看所采用的检测技术，单晶衍射重原子法如Mo靶，Ga靶可以准确判断手性碳的绝对构型，或者圆二色谱CD和旋光光谱ORD通过与确认过绝对构型的参比进行比较或者通过理论计算实验值与理论值进行比较，也可以真实反应空间的绝对构型。简而言之，相对构型是和某个参考物比较，绝对构型是空间实际的排列取向，相对于与甘油醛为参比的小分子，如氨基酸等的手性，相对构型的DL标记与绝对构型的RS碰巧一致，但对于一些有多个手性中心的其他分子RS和DL标记法并不会平等替换，看到手性分子RS也并不都是绝对构型，得看检测技术和手段是否能够反应空间真实取向。

图2 甘油醛偏振和手性示意图

讲叙这些内容，核心是为了强调作为结构分析工作者，需要对基础有机化学知识，谱图分析技能，和软件使用情况都有很高的要求，这样能让科研节省时间和金钱成本，能少走很多弯路。以下就是我们在实际工作中的一个案例。我司客户的一个API产品，工艺上产生了与主成分贴很近HPLC面积归一化占比约0.1%且分子量与主成分一致的未知杂质，如图3，根据分子量与分子式与主成分API一致，我们初步判断该杂质为主成分的同分异构体，至于是位置异构还是立体异构还需要进一步判断，经与客户确认需要我们在一天内制备少量杂质并进行结构解析。

图3 目标物和杂质的相关HPLC谱图

制备得到少量杂质，我们检测得到该杂质的核磁数据，并用ACD/Labs NMR Workbook对该核磁数据进行分析，仔细归属，发现未知杂质应该为API的C21位的乙基与C24位的甲基互换位置的位置异构体，即API中C21位为乙基，而未知杂质C21位为甲基，如图4，并初步将结构反馈给合成人员，但合成部门同事并不认可解析结果，他们认为从机理上讲两者位置互换不太可能，于是一而再再而三要求重新分析数据。

图4 NMR解析杂质的结构

从普通C18能够将该杂质与主成分API分开，我们初步倾向于目标杂质与API为位置异构体或非对映异构体，且合成人员反馈API中的2个手性中心的4个立体异构体都已经经过定向合成确认，这给我们解析出的上图的位置异构体更增添了一些信心，但为避免对软件的熟练程度和人为归属带来的差错，我们使用ACD/Labs NMR Workbook软件进行自动谱图与结构验证，软件归属验证完成后，给出0.91的匹配因子（匹配因子越靠近1，表示谱图与结构越吻合），如图5。这更增加我们对解析出来的结构的信心，于是回复合成同事，NMR解析的结构没有问题。

图5 ACD/Labs NMR Workbook归属验证打分

双方僵持不下，合成同事提出使用甲乙基侧链取代的起始物料，如图6，去进行定向合成，理论上得到的产物应该与解析的结构吻合，但是问题又来了。

图6 定向合成使用原料

完成定向合成后，合成部门同事将合成出来的样品与制备杂质同时进行HPLC检测，合成样品色谱图存在3个峰，如图7，2个主要的大峰均与制备杂质样品的保留时间不一致，因此合成部门同事坚持认为杂质解析结构有误，理由是定向合成的保留时间与制备杂质保留时间不一致，但我们认为制备杂质的结构没有问题，至少说平面结构没有问题，猜想可能是结构中存在手性，保留时间对不上是因为合成样品与制备样品互为旋光异构体的缘故。

图7 定向合成样品与制备杂质样品手性方法LC叠加图

接下来把合成样品和制备样品使用同样的氘代溶剂采集NMR谱图，两者谱图进行比对发现，合成样品谱图存在2套数据峰，其中一套峰与制备样完全重叠，如图8.此结果完全验证了之前的想法，究其原因是合成起始物料中存在2个手性中心，所以理论上会得到4个旋光异构体，2对对映异构体，2对非对映异构体，在NMR中对应异构体核磁数据完全一致，因此合成杂质的信号分成2套，制备得到杂质样品是这4个旋光异构体其中的一个。把数据比对的结果和猜想反馈给合成部门同事，确认合成使用手性柱进行拆分，手性柱有能检测4个构型的能力，但分析方法优化的局限性只出了3个峰。幸亏我们在ACD/Labs NMR Workbook软件的加持下对NMR解析结果有足够的自信，通过对两个不同来源的样品进行了NMR谱图比对发现了真正的原因，不然真有可能会考虑解析有误，再走很多弯路，且此项目正处申报阶段的关键时刻，节约的时间和成本不可小觑。

图8 上图为制备样品，下图为合成样品的碳谱

由于物质结构的差异，非对映异构体一般用HPLC普通色谱柱就能分离，未必需要直接上手性柱。合成团队的定制合成样品，直接用API的HPLC原方法检测，所得杂质与制备的目标峰的保留时间能完全对上。

最后，借用萧柏明老师的一句话，手性杂质（即对映异构体杂质）参照ICHQ6制定质量标注，而非手性杂质（即非对映异构体杂质）可以参考ICHQ3A和ICHQ3B的有关物质研究即可。若对非对映异构体杂质用手性柱分析，有时很有用，但也可能发生过度研究。

致谢：

感谢ACD/Labs葛老师的技术支持，顺利完成了该杂质结构解析和判断。

ACD/Labs阎作伟的评述