色谱模拟的基础知识
第一节 反相洗脱强度的模拟
AutoChrom指南：背景知识
前言
色谱模拟技术从开始被创造并在1985年制成首款软件，至今已过40年。软件模拟色谱行为已经有了非常大的进步。在色谱方法建立过程中，无论采用何种色谱体系，软件模拟都可以用来替代许多优化分离效果的实际实验步骤，能够减少实验操作，找到更理想的最终的实验条件。当前色谱模拟技术已经作为自动化系统化色谱分析方法开发的一部分，成为其不可分割的组成。
我曾经听到一位资深科学家提到“在工艺研究工作中，不能拿来建立模型的实验都不应做”，这句话带来我认知上的强烈震撼。通过模拟，我们对要达到的目的有了更准确的预判和控制力，研究的水平得以提高，知识得以丰富。
ACD AutoChrom 软件包中LC-Simulator是负责色谱模拟的工作组件，是分析方法开发工作者的常用的帮手。本文内容收集整理了在色谱模拟领域经过广泛验证的公式，以及部分的案例作为入门必读的基础知识材料。
本书除了包含液相色谱方法开发过程中会用到色谱模拟的知识之外，还包括理化性质预测，色谱柱化学和统计学应用，是ACD AutoChrom 用户必读的背景知识材料。
本文的第一章为色谱模拟理论基础，知识内容核心来来自于施耐德先生的色谱导论书籍和近期文献。其中所引用的公式数量已经被大大精简，读完此部分再阅读施耐德先生的原著会更加便捷。第二章，第三章分别讲述色谱多因素模拟在小分子和大分子研究过程中的应用情况。第四章讨论理化性质，第五章讨论色谱柱的选择性的信息学研究、第六章讲述统计学和耐用性研究。第七章讨论一些其他的液相色谱的模拟，包括IPC，HILIC, MIX Mode等。第八章预留空间记录亲身经历过的色谱方法开发项目。
期望此本书能够令读者从基础上掌握进行软件辅助色谱工作的最基本原理和要点，能够根据自己的工作所需，合理的使用ACD AutoChrom软件，做出杰出的工作。
目录
第一章 色谱模拟的基础知识
第一节 反相洗脱强度的模拟
第二节 梯度的模拟
第三节 温度的模拟
第四节 溶剂类型的模拟
第五节 pH的模拟
第六节 正相洗脱强度模拟
在反相体系中，溶质分子的保留随着流动相的洗脱比例的变化而变化。反相体系中为读者最常见的现象是在低比例的有机相时溶质分子的保留时间明显大于高比例有机相下的保留时间。
这种现象可以通过公式进行拟合。
公式1-1是反相等度的保留行为拟合公式。其中kw表示使用外推法获得的纯水（最弱的洗脱能力）时溶质分子的保留因子。Φ表示有机相的体积百分比，而S则是分析物的固有属性，是一个常数。
公式里的k表示溶质分子的保留因子。
图1-1 logk随等度%B变化而变化，样品为对硝基甲苯，反相。
通过对硝基甲苯的logk与有机相比例%B作图所知，公式1-1在较宽的%B范围内在甲醇和乙腈两种强洗脱剂下都具有良好的一致性。
S作为分析物的固有属性和分子的形态大小，电荷多少，构象特征等等密切相关。通常来说分子量越大，S值越大。相似的物质具有相似的S值。当物质只具有一个手性中心时，普通的反相体系下两个对映异构体的S值是相同的，因此有机相比例的变化不会带来选择性的变化。
在实际的色谱工作研究当中，可以应用公式1-1，对物质间的分离情况进行预测。例如，对于两个小分子化合物，记录其5%和10%的保留时间，转化为保留因子，再计算其对数，如表1-1。可以建立线性关系并外延用来预测其他条件下的保留时间，了解其变化的趋势，如图1-3。
图1-2 两个小分子化合物的5%和10%等度时的保留图
表1-1 保留因子和保留因子的对数值
图1-3 两个小分子的logk 随 B%变化而变化图
化合物如果母核结构相同，仅在特定结构单元部分有规律性的差异，其对有机相比例%B会有类似于图1-4的表现。而如果化合物母核结构差异很大，分子的形态结构特征也由区别，则其对有机相比例%B会有类似于图1-5的表现。由此可见，当样品数量增多且结构差异变化大时，其色谱表现的相互关系便复杂起来了。
图1-4同系物的logk随等度%B变化情况
图 1-5差异性的样品 logk随等度%B变化情况
看一个反相等度的例子，如图1-6所示，基于公式1-1，两张色谱图1-6(a) 和1-6(b)，可为7个物质建立线性方程logk=a+bx。令x即B%连续变化，求得上下边界之间的每个色谱峰的保留时间，并向两侧外延预测每个色谱峰的保留时间。基于公式1-3, 计算所有峰对之间的分离度Rs，并记录最小分离度。将最小分离度和变量进行作图，所得即为等度比例与最小分离度的关系，如图1-6(c)，图1-6（c）红圈处标记为预实验点。
Wi和Wj是色谱峰i，j的基线峰宽。
图1-6 (a) 10% B 等度的RPC实验图 (b) 20 % 等度的RPC实验图 (c) 对分离度进行综合评估的分离度图
基于保持线性的特点，外延设计模拟计算5%-30%范围的分离情况，以最小分离度做图显示为1-6(c)，分离度图提示了17%时最小分离度为最高，25%和9%为次。图1-7是对这些条件的验证。在分离度图1-6(c)上，分离度1.5处画一条阈值线，可获得这三个解的有效范围，为等度条件的耐用性范围。
图1-7 9%，17%和25% 时色谱的保留和分离情况
分离度图是色谱模拟的核心，进行分析时应抓住对分离度有利的机会进行决策。理解并使用分离度图，对分离效果进行预测以及选择是使用色谱模拟软件时的必须掌握的技能。
当研究的对象从小分子拓展到大分子，例如具有二级或者复杂结构形态的肽，蛋白，核苷酸，多糖等分子时，公式1-1依然起作用。图1-8显示了蛋白的一级序列到四级结构的差异性。但有一些有趣的现象应留意，图1-9里，对小分子和部分生物大分子的logk 随有机相比例变化而变化的图中可以发现这些生物分子的线段的形态都很陡峭。结构单元越大，陡峭的程度越大。这种陡峭会令等度洗脱研究非常困难，因此生物分子进行研究时都使用梯度进行洗脱。
图1-8肽的一级序列，二级结构以及蛋白的三级和四级结构
图1-9 溶质分子为苯，9肽，促肾上腺皮质激素（1-26），胰岛素，细胞色素C的logk随B%变化图
小结
公式1-1告诉我们使用2个预实验即可对反相洗脱强度的影响进行拟合和预测，其外延性也会比较好。
