用主成分分析法对市售的反相液相色谱全氟化固定相进行色谱分类和比较
摘要：作者使用标准色谱测试程序和探针对十种全氟苯基相和全氟烷基固定相进行了评估。使用主成分分析结果表明，这些固定相可以分为不同的组。将数据集扩展至包括标准烷基相和苯基相，提供了进一步的数据用于支持对全氟相所作的正交选择性结论。对一系列碱性分析物的分析表明，亲水碱性分析物在全氟固定相上的保留出乎意料地延长了。此外，对于亲水碱性分析物，有机改性剂的量与保留因子的对数之间存在非线性关系，这与所研究的烷基相和苯基相形成鲜明对比。碱性分析物在全氟烷基相上的保留行为可以用于模拟亲脂碱。对这些全氟相的保留机制的研究表明，硅烷醇相互作用在保留和选择性中非常重要。使用快速、等度、高有机改性剂的方法，可以在4min内用全氟苯基相分析含有亲脂类固醇、亲水碱和内标的混合物。这以前这些物质只能在梯度洗脱条件下用烷基色谱柱来实现。
Part.01
介绍
由于全氟化固定相具有独特的分离选择性，因此在反相液相色谱中作为传统C18和C8固定相的替代品正得到越来越广泛的应用。因此，大多数固定相制造商现在持有上述固定相组合中的一种。研究表明，全氟化固定相在分析卤代化合物时表现出更强的保留和选择性，并且对于其位置/几何异构体的形状选择性更强。与传统的C8和C18固定相（使用甲醇、四氢呋喃或乙腈作为流动相）相比，全氟化固定相在流动相中使用氟化醇作为有机组分，使其选择性得到了进一步增强。与C8和C18固定相相比，全氟化固定相中的C-F键被认为有更大的偶极性，这增加了固定相与极性和卤素化合物的相互作用。相比于传统C8和C18固定相，全氟化固定相含有的额外的分析物与固定相的相互作用（C-F偶极作用、π-π作用以及固定相的刚性所提供的增强的形状选择性），可能为色谱分析提供了烷基类固定相所无法获得的独特选择性。
全氟化固定相也被发现用于分析非卤代化合物，如天然产物(即类固醇、类胡萝卜素、类黄酮、多酚、儿茶素、紫杉烷、磷脂、头孢菌素和生物碱)、药物起始原料的位置异构体、除草剂和非离子表面活性剂。
最近，人们对使用有机含量高的全氟化固定相产生了很大的兴趣，因为这种方法增加了碱性分析物的保留，并能增强LC/MS喷雾特性。
主成分分析(PCA)在固定相的表征中有很大的作用，并帮助我们更好地理解潜在的保留机制。
本项工作的目标是描述一系列烷基和全氟苯基固定相的疏水选择性、形状选择性、氢键作用力和在 pH 值为 2.7 和 7.6 时的离子交换能力，并将它们的保留行为与传统的苯基和烷基固定相进行比较。用PCA比较了两种固定相的色谱性质，并从基体二氧化硅和制备过程中采用的键合技术等方面讨论了它们的异同。
此外，还对这些氟化固定相的色谱性能进行了评估，以对一系列具有广泛不同亲脂性和pKa值的碱性分析物进行分析。
这些全氟化固定相和非氟化固定相的色谱参数已被用于解释这些固定相在高有机含量流动相中使用时的高保留能力，因为这种方法越来越受LC/MS研究的青睐。
Part.02
实验
2.1 化学试剂
所使用的溶剂均为Romil (Cambridgeshire, UK)提供的HPLC级以上溶剂，除了水是由Milli-Q-plus 185超纯水系统(Molsheim, France)提供的。
盐酸苄胺、正戊苯、正丁基苯、苯并菲、邻三联苯、咖啡因和硫脲均由Sigma-Aldrich(Dorset, UK)提供。苯酚、KH2PO4、H3PO4和KOH由Fisher Scientific (Leicestershire，UK)提供。普萘洛尔由Sigma-Aldrich公司(Dorset, UK)提供。
研究选择了10种与药物相关的碱性分析物，涵盖了一系列的pKa和log P值。其中包括由Sigma-Aldrich(Dorset，UK)提供的盐酸苯胺、盐酸苯海拉明、去甲替林和硫酸沙丁胺醇，由Fluka(Dorset，UK)提供的尼古丁(自由碱)和盐酸普鲁卡因胺，以及阿斯利康研发Charnwood (Loughborough，UK)化合物库提供的四种阿斯利康化合物AR-R12495、AR-C68397、AR-R12924和AR-D080301-均以0.3 mg/mL溶于水(除AR-C6839溶解在pH为2.7的20 mMKH2PO4p缓冲液中)。
亲水性混合测试溶液由100 μl的尼古丁、盐酸苄胺、盐酸普鲁卡因胺、AR-D080301、硫酸沙丁胺醇和苯酚加500μl水组成。
亲脂性混合测试溶液由100 μl 的AR-C68397、AR-R12924、AR-R12495、去甲替林、苯海拉明和苯酚溶液加500μl水组成。
各碱性分析物的结构、pKa和log P值见图1。
图 1
2.2 仪器
HPLC分离在Agilent 1100液相色谱仪(Agilent Technologies, Cheadle, Cheshire, UK) 上进行，配备色谱柱切换阀(Jones Chromatography, Mid. Glamorgan, UK)和Mistral柱温箱((Spark Holland B.V.,Emmen, The Netherlands)
MS工作在配备电喷雾接口的Agilent Technologies series 1100 LC/MSD (Agilent Technologies, Waldbronn，Germany)上进行。
2.3 液相色谱
所有色谱柱均为制造商/供应商提供的新柱。表1突出显示了制造商/公布的已评估固定相的可用数据。
表 1
用于液相色谱表征的色谱条件参照文献。甲醇进样时基线的第一个波动记为死时间。
表征6个反映色谱性质的不同变量。下面对每个变量进行简要描述。进样量和流速已经基于150mm*4.6mm色谱柱进行了转换。
戊基苯的保留因子，kPB：反映表面积和表面覆盖率(配体密度)。色谱条件：MeOH-H2O (8:2, v/v)， 1.2ml/min, 40℃, 进样体积5μl (戊苯0.6 μg/ml，以甲醇为稀释剂)。
疏水或疏水选择性，aCH2：戊苯和丁基苯之间的保留因子比，aCH2=kPB/kBB。这是对固定相表面覆盖率的度量，因为由一个甲基分化的烷基苯之间的选择性取决于配体密度。色谱条件：MeOH-H2O (8:2, v/v)， 1.2 ml/min, 40℃, 进样体积5μl (戊苯0.6 μg/ml和丁基苯0.3 μg/ml，以甲醇为稀释剂)。
形状选择性，aT/O：苯并菲和邻三联苯之间的保留因子比，aT/O=kT/kO。这是对硅烷键合基团的形状选择性和功能的度量。色谱条件：流动相同“疏水选择性”项下，进样体积5μl (苯并菲和邻三联苯各0.05 mg/ml，以甲醇为稀释剂)。
氢键能力，aC/P：咖啡因与苯酚的保留因子比，aC/P =kC/kP。这是对可用硅羟基数量和封端程度的度量。色谱条件：MeOH-H2O (3:7, v/v)， 1.2 ml/min, 40℃，进样体积5μl (苯酚1mg /ml和咖啡因0.5 mg/ml，稀释剂MeOH-H2O (3:7, v/v))。
总离子交换能力，aB/P pH7.6：苄胺与苯酚的保留因子比，aB/P pH7.6=kB/kP。这是对总硅烷醇活性的度量。色谱条件：MeOH-H2O (3:7,v/v,含20mMKH2PO4，pH7.6), 1.2 ml/min, 40℃，进样体积5μl（苯酚和盐酸苄胺分别进样，浓度均为0.5 mg/ml）。
酸性离子交换能力，aB/P pH2.7：苄胺与苯酚的保留因子比，aB/P pH 2.7=kB/kP。这是衡量硅烷醇基团酸性活性的指标。色谱条件：与上述总离子交换测定的条件相同，但使用pH 2.7 KH2PO4缓冲液。
亲水性碱性化合物分析：色谱条件：MeOH-H2O (3.3:96.7, v/v, 含20mMKH2PO4，pH2.7)，1.0 ml/min, 60℃, 进样体积5μl（亲水性混合测试溶液，在210 nm处检测）。
亲脂碱性化合物分析。色谱条件：MeOH-H2O (45.5:54.5, v/v, 含20mMKH2PO4，pH2.7)，1.0 mL/min, 60℃, 进样体积5μl（亲脂性混合测试溶液，在210 nm处检测）。
2.4 使用的软件
2.4.1 主成分分析
采用Simca-P 8.1软件(Umetrics，Sweden)进行主成分分析。表征色谱柱的六个变量都被纳入分析。
2.4.2 Log P和pKa预测
使用Advanced Chemistry Development软件程序(Toronto, Canada)用于pKa和log P的预测。
2.5 LC/MS
采用LC/MS分析，色谱柱为Fluophase PFP柱(150mm*3mm，5μm)，流动相为ACN: H2O (6:4, v/v, 含10 mmNH3HCO2H，pH2.7)，流速为0.8 mL/min，恒温柱温为20℃;采用电喷雾质谱法(MS)进行单离子监测(SIM)，操作参数为:干燥气体温度325℃，干燥气体流量12 L/ min，雾化气体压力345 kPa，毛细管电压3 kV，Fragmentor电压70 V。
Part.03
结果与讨论
3.1 主成分分析
前期已经描述过的色谱柱表征程序的结果可以在表2中找到。色谱柱的编号来自我们的色谱柱数据库；这一大型研究的结果将在后期进行报道。
表 2
PCA是解释大型数据库的通用工具[23]。在PCA中，通过将对象 (固定相)投影到较小的新变量集 (PC，主成分)上，可以在更小维度上利用新变量进行分析(在本例中，降维为六个特征参数)。第一主成分应尽可能多地保留对原始变量的解释，第二主成分以与第一主成分正交变换的方式确定，并且旨在尽可能多的保留对原始变量的解释。
目标(固定相)在PC上的投影被称为分数-通过绘制两个PC上的散点图，可以发现固定相间的异同点。散点图中目标之间的距离可以体现出它们是相似还是不同。
PC与每个原始变量之间的关联程度通过载荷来描述（每个独立变量一个值）。通过绘制两个PC的载荷，可以看出哪个原始变量的影响最大(即：到原点的距离最远)，以及是否有变量是相关的(即：在通过原点的直线上是相同或相反的方向)。
通过贡献图，可以很容易地确定两个目标（固定相）不同的因素。这种类型的图显示了哪些变量(色谱参数)导致两个目标(固定相)之间的差异，或者一个固定相和整体固定相之间的差异。
可以得出结论，10个全氟相的PC1-PC2模型描述了这些固定相中84%的色谱变异性。PC1-PC2得分图突出显示，十个全氟相可以分为三个亚组(见图2.a)。
A组包含全氟苯基相(色谱柱号14、20、26、61和71)，而B组包含全氟己基封端相和全氟辛基相(色谱柱号24、27和28)，C组包含全氟己基非封端相和丙基相(色谱柱号25和72)。
载荷图(见图2.b)突出显示，A-C亚组具有以下优势色谱性质：A组，高表面积/疏水性，高形状选择性(与kPB，aCH2和aT/O参数正相关)，低离子交换和氢键活性(与aC/P，pH 2.7和7.6的aB/P参数负相关);B组，低表面覆盖率/疏水性，低形状选择性(与kPB，aCH2和aT/O参数负相关)和高离子交换(与pH 2.7和7.6的aB/P参数正相关);C组，低表面覆盖率/疏水性，低形状选择性，低离子交换活性(与kPB，aCH2，aT/O以及pH 2.7和7.6的aB/P参数负相关)和高氢键容量(与aC/P参数正相关)。
这些发现与FluoroSep-RP phenyl HS相(A组，柱号71) 和Fluofix端封相(B组，柱号24)之间的PC1-PC2贡献图(图3)一致，这突出表明，与全氟烷基相相比，A组固定相表现出更高的保留力(由于其高表面积)，高形状选择性(苯基相与烷基相相比)，低氢键和离子交换能力(由于更高的配体键合密度或受阻的空间可及性)。
图 2
图 3
相比之下，图4突出了FluoroSep-RP Octyl(B组，柱号28)和Fluofix非端封相(C组，柱号25)两相之间的主要区别，与Fluofix非端封相比，FluoroSep-RP Octyl似乎具有更大的酸性硅烷醇和更低的氢键能力。
图 4
在C18相的PCA分析中，色谱参数aC/P和pH 7.6下的aB/P显示出高度的相关性，与此相反，在我们的数据库中研究的全氟相，没有表现出相关性。
为了比较这些全氟相和非全氟相的色谱性质，我们在数据库中添加了两个苯基相和三个烷基相。不幸的是，无法获得与全氟相相同的基于碱性二氧化硅的非全氟相。
众所周知，大多数(如果不是全部的话)全氟相是以高纯度二氧化硅为基质的，因此选择了以纯二氧化硅为基质的苯基(XTerra和ACE)和烷基(HyPURITY范围)作为比较。
随着数据集的增加，PC1-PC2得分图(见图5.a)占数据变化的75%，并产生了全氟烷基和全氟苯基相的两个不同组。与全氟苯基相比较，全氟烷基相表现出较低的保留力、形状选择性(即与aT/O、aCH2和kPB参数负相关)和增强的氢键和离子交换能力(与aC/P、pH 2.7和7.6条件下的aB/P参数正相关)。全氟苯基相表现出更大的保留和增强的形状选择性(即与aT/O、aCH2和kPB参数正相关)(见图5.b)。联苯相在色谱性质上与全氟苯基相不同。Monochrom MS（典型的全氟苯基相，柱号61)与XTerra或ACE苯基(色谱柱号117和4)(见图6.a为XTerra结果) 的PCA贡献图，强调了与苯基相相比，全氟苯基相的形状选择性增强，这可能归因于全氟相的刚性，并可能部分解释了位置/几何异构体的高选择性[1-3]。在我们研究的135个RPLC色谱柱中[22]，全氟苯基相的形状选择性值最高(aT/O>2.5)，而全氟烷基相的形状选择性值最低(aT/O<0.7)，也就是说，这些固定相对三联苯、苯并菲的洗脱顺序不同。其他RPLC固定相通常显示1到2之间的aT/O值。
全氟烷基相的保留率远低于HyPURITY C4、C8或C18相(见图6.b)，而全氟苯基相的保留率与C4和C8 HyPURITY相相似。固定物制造商声称，全氟烷基相具有与C1或C4相相似的保留特性。
图 5
图 6
3.2 全氟相在碱性分析物分析中的评价
在分析一系列不同亲脂性和pKa的碱性分析物时，使用pH 2.7的20 mM KH2PO4在不同比例的MeOH/水中对这些全氟化相(加上两个苯基相和一个C18相进行比较)进行了评估。分别以MeOH-水（3.3: 96.7，v/v）和MeOH-水（45.5:54.5 ，v/v）作为亲水性混合测试溶液和亲脂性混合测试溶液的流动相，并在每种混合物中加入苯酚作为对照标记物。
与非全氟苯基相和C18相相比，全氟苯基相(如图7 a所示)表现出更强的亲水碱性分析物的保留(见图7.b和图10.a)。在Fluphase PFP色谱柱上，亲水性碱沙丁胺醇(化合物5)在30分钟内未能洗脱(见图7 a)。不出所料，烷基链较低的全氟相(见图7.c，图7.d，图7.e和图7.f)的保留力不如全氟苯基相。观察到，在全氟相上进行的20min和60min梯度LC实验中，Drylab 2000 LC预测软件无法正确预测这些亲水性碱和苯酚的洗脱顺序。这与观察到的HyPURITY C18和ACE苯基相形成对比。HyPURITY C18和ACE苯基相的模拟与实验值非常接近。当为Discovery F5 HS 全氟苯基相(离子强度常数)构建log k与甲醇百分比的曲线图时，全氟相建模的不足变得明显，其中对碱性分析物的分析未能表现出log k与甲醇百分比之间的线性关系(见图9)。与碱性分析物相反，中性分析物苯酚表现出预期的线性关系，这表明分配理论并不完全控制亲水碱的保留机制。如图中峰的交叉所示，图9突出了这些固定相在控制和利用选择性差异方面所具有的有趣性质，如果这些全氟苯基相用于使用梯度LC条件进行色谱柱选择的固定相筛选程序，则可能必须采用非标准LC预测模型。
使用Fluofix封端和FluoroSep-RP辛基相，log k与甲醇百分比曲线图对于亲脂碱似乎是线性的，因为模拟和实验获得的保留时间之间有很好的一致性。这是不可能评估这与来自两个梯度方法的全氟苯基相，因为碱性分析物在梯度的线性部分未能洗脱。
在烷基和苯基相的所有情况下，碱性分析物都先于中性分析物苯酚被洗脱，然而，全氟相的情况肯定不是这样(见图9)。流动相中log k与甲醇百分比的斜率差异进一步支持了质子化碱和中性苯酚之间保留机制的差异。
分析物尼古丁和普鲁卡因胺(化合物1和4)似乎非常容易受到硅烷醇相互作用的影响，在非封端和封端Fluofix固定相(柱号分别为25和24，见图7.e和图7.f))的比较中，与其他分析物相比，这些分析物在非端封固相上保留的时间更长。在FluoroSep-RP辛基相上，尼古丁和普鲁卡因胺也观察到非常宽且保留的峰(见图7.c)。与苯基相和烷基相相比，氟相具有正交选择性，特别是在分析亲水性碱性分析物时，这在药物纯度筛选中是非常理想的。全氟苯基相(柱26)和XTerra苯基固定相(柱117)的对比，清楚地突显了保留机制的正交性，如亲水性(化合物3、4和5，分别见图7.a和7.b)和亲脂性碱性分析物(化合物7和9，分别见图8.a和8.b)。
通过比较亲水性分析物(见图7.e和图10.a)和亲脂性碱性分析物(见图8.f和图10.b)在全氟烷基相(例如封端Fluofix固定相，柱24) 和常规C18相(HyPURITY C18，柱42)上获得的不同洗脱顺序，可以得出类似的结论。研究表明，与苯基或烷基相相比，全氟苯基相对碱性分析物的保留率要高得多(见图8.a，图8.b，图10.b)。事实上，亲脂的去甲替林(化合物11)在Fluophase PFP柱上未能在30分钟内洗脱(见图8.a)。
图 7
图 8
图 9
图 10
3.3 利用含高有机溶剂的流动相研究全氟相的保留机制
全氟相在含有高比例有机溶剂的流动相中表现出对碱性分析物的高保留能力，对色谱分析来说是极具吸引力的。用传统的C8或C18反相固定相（为了保留碱性分析物，需要高水/低有机含量的流动相）进行亲水碱的LC/MS分析可能存在问题。这些流动相条件会导致MS灵敏度的降低，这是由于喷雾效果差和水滴表面张力的增加。相比之下，使用高有机含量的流动相加上使用挥发性缓冲液，如甲酸铵，有助于LC/MS中的脱溶过程，从而提高灵敏度。
另一个潜在的问题是，如果较早的洗脱峰不能从溶剂峰中分开，那么由于共洗脱基质成分，MS信号可能会受到抑制。
为了更好地理解这些全氟相的保留机制，我们绘制了一系列不同logP和pKa值的碱性分析物的保留因子与流动相中乙腈百分比的分析图。这显示了一个典型的反相机制(见图11)。疏水碱基随着乙腈百分比的增加而表现出保留率的下降，而亲水碱基则不遵循这一趋势，因为它们在死体积附近被洗脱。这与类似的全氟苯基相(即单色MS)形成对比，当与含有超过80%乙腈的流动相一起使用时，普萘洛尔和阿米替林的保留系数极高。当考察碱的保留率作为缓冲液浓度倒数的函数时，可以很容易地解释这一原因(见图12)。图12显示了两种机制;在高缓冲浓度(即> 0.5 mM)下，观察到典型的反相行为，而在0.5 mM时，离子交换机制占主导地位。
这表明，当在不保持缓冲液浓度不变的情况下增加乙腈的百分比时，离子交换机制将占主导地位，因此碱的保留将增加。
如果是这样的话，那么可以预期，当使用高百分比的乙腈和低离子强度时，传统的基于酸性二氧化硅的反相材料(如Hypersil ODS)也会表现出高的碱保留率。图13证实了在高有机和低缓冲液浓度的LC条件下，两种碱性分析物在Hypersil ODS相上的高保留率。因此，全氟相在这些具有高有机含量的流动相中的保留机制被认为类似于亲水性相互作用色谱(HILIC)。
图 11
图 12
图 13
3.4 LC/MS
采用高有机含量流动相、挥发性缓冲液和全氟苯基相的LC条件已被证明适用于一系列碱性分析物的LC/MS分析。如普萘洛尔、阿米替林、品多洛尔、伪麻黄碱、苯海拉明、氯苯那明、安非他明和可卡因[10]。我们已经证明，使用这种方法可以对含有亲脂性类固醇、亲水碱性化合物以及合适的基本内标物的潜在药品进行快速分析(见图14)。使用传统的RP-LC方法，在合理的时间范围内洗脱亲脂性类固醇所需的高有机含量流动相条件将导致碱性化合物不保留。相比之下，使用保留和分离碱性化合物的低有机含量流动相条件会导致亲脂类固醇的过度保留。因此，当人们将MS优势与色谱优势结合起来时，很容易看到这种方法可能提供的巨大潜力。
图 14
Part.04
结束语
可以得出结论，PCA的化学计量学方法是一种非常有效的工具，可以显示十种全氟相在色谱性质方面的相似性和差异性。这是特别可取的，因为无论是从制造商还是在已发表的领域中，有关这些全氟相的色谱特性的信息都非常少。本文使用标准测试程序对这些固定相的色谱特性进行了无偏评估。PCA强调，与传统的烷基和苯基相相比，这些全氟相的主要区别似乎是它们对形状选择性的高分辨能力。PCA的贡献图被证明是一种非常直观的方法来突出固定相之间的差异。对于亲水性和亲脂性碱，与常规固定相相比，全氟相的正交性已经建立起来。与非氟固定相相比，碱性分析物在全氟相上的保留率要高得多，而中性分析物的保留率要低得多。在含有高有机改性剂和低缓冲浓度的流动相中，碱性分析物在全氟相上的高保留率似乎是由HILIC机制控制的。这些全氟相在含有亲脂类固醇和亲水碱加上基本内标的混合物的快速LC/MS分析中的适用性已成功凸显。
