摘要:随着全球人口的增长,我们需要稳定的蛋白质供应来满足需求。尽管植物来源的蛋白质广泛可用,动物肉类仍因其高品质和美味而受到欢迎。最近,通过体外细胞培养技术生产的培养肉(也称为体外肉)被提出作为一种肉类类似物。培养肉比传统肉类有几个优势,如环境保护、疾病预防和动物福利。然而,培养肉制造是一项新兴技术,其进一步和动态发展至关重要。培养肉商业化面向公众将需要很长时间,但培养肉无疑有一天会出现在我们的餐桌上。在这里,我们讨论了培养肉生产的社会和经济方面以及培养肉技术的最新技术进展。
1.引言
当前全球人口为73亿,预计到2050年将达到100亿。因此,这样的增长可能导致蛋白质需求是当前蛋白质产量的两倍。由于传统的肉类生产系统,如畜牧业,已不再可持续,科学家们一直在寻找替代蛋白质来源。早期的肉类替代品尝试集中在使用基于大豆、小麦或真菌蛋白的植物基肉类类似物。直到最近,研究人员才开始尝试使用培养的肌肉细胞作为真正肉类的替代品。培养肉,也称为体外肉,是一种使用体外细胞培养技术生产的肉类类似物,其中动物细胞主要是通过肌肉活检和屠宰牲畜分离出的骨骼肌衍生细胞。
培养肉技术受到了广泛关注,因为许多人认为这项技术可以补充或部分替代传统的动物生产系统。实际上,传统的动物生产系统一直是农业最重要的部分。然而,在过去的几十年里,人们和研究人员对传统动物生产系统提出了担忧,因为它可能引起包括环境和社会问题以及动物福利问题在内的几个问题。
2013年,荷兰马斯特里赫特大学的Mark Post首次从原始牛骨骼肌细胞中生产出培养肉。从那时起,一些大学实验室和公司进入了这一研究领域。后来,另一家美国初创公司Memphis Meats生产了几种培养肉产品,如肉丸、牛肉法士达、鸡肉和鸭肉。此外,JUST,一家素食饼干面团和蛋黄酱公司,宣布他们将首次推出培养鸡肉块。此外,一家初创公司Modern Meadow开发了一种由培养肉和水凝胶制成的牛排片。自2013年首次推出培养肉饼以来,几家私营公司已经成立并专注于培养肉生产。
尽管与培养肉领域有许多技术困难,但至少一些全球问题可以通过这项技术的成功发展来解决(表1)。因此,本综述总结了当前培养肉生产的问题和技术发展,特别关注三个领域:1)培养肉的社会和经济方面,2)各种牲畜肉类培养的生物学基础,以及3)培养肉生产技术方法。
1.1.培养肉生产系统的社会和经济方面
1.1.1.培养肉的经济可持续性
培养肉系统与传统畜牧业相比,需要更少的水、土地、饲料谷物和能源。此外,培养肉系统可能比传统畜牧业展现出更高的转化率,后者的转化率在5%-25%之间。因此,培养肉可能是一种理想的替代品,因为它潜在的可持续性和小的环境影响。例如,今天用于培养肉生产的最大规模的20立方米生物反应器,每年可以生产25,600公斤的培养肉。假设在培养肉生产过程中没有损失,这代表了每年为2,560人提供培养肉的估计供应量。喂养2,560人的计算基于Van der Weele和Tramper(2014年)的假设,即全世界每个人都将每天吃25-30克的培养肉(每年10公斤)。考虑到这种生产只需要每天几小时的劳动来维护生物反应器,培养肉生产是当前畜牧业肉类生产的潜在低成本替代品。此外,据报道,培养肉汉堡的价格在2年内从325,000美元降低到每个汉堡11.36美元或每公斤肉80美元。培养肉的另一经济好处可以在其分配中找到。通过将培养肉生产设施靠近城市,可以大幅降低运输成本。此外,在食物浪费方面,传统肉类行业在废物管理方面存在大问题,因为整个尸体不能用于消费。然而,培养肉系统可以单独提供优质切割用于消费和进一步加工,这将是一个实质性的经济好处。
1.1.2.人造肉的环境可持续性
当前的畜牧业系统对环境产生负面影响,引发环境可持续性问题。尽管畜牧业使用的水大部分会返回到环境中,但相当一部分水被污染或蒸发。这种污染是由畜牧业和饲料生产以及产品加工引起的,进而增加了对水的需求。为了生产1公斤牛肉,需要15,495升水,其中99%的水用于谷物和粗饲料(例如,牧场、干草和青贮饲料)的生长。仅有1%的水(约155升)用于动物饮水和服务。这种需求主要归因于动物的饮用水需求,以及作物和植物生长。水污染和消耗可能导致通过破坏野生动物栖息地破坏生物多样性。然而,人造肉技术使用的水比传统畜牧业少约82%-96%。总的来说,畜牧业需要30%的总陆地面积——33%的耕地用于饲养牲畜的饲料,26%用于牧场。然而,人造肉生产系统仅使用传统畜牧业所需土地的1%。尽管如此,这种假设仅限于基于藻类的培养基生物质的生产,因此不同培养基的生产成本和效率因此不确定。尽管人造肉生产系统比传统畜牧业需要的土地更少,但人造肉生产系统至少需要比传统畜牧业多四倍的能量。具体来说,人造肉需要18-25吉焦/吨的直接能量,而生产传统肉类需要4.5吉焦/吨的直接能量。畜牧业消耗直接能量,如照明、加热和冷却,而人造肉生产系统需要肌肉细胞培养的能量,以及细胞培养基所需的生物质材料的消毒和水解。畜牧业提供了所有食物中四分之一的蛋白质含量(和15%的能量),并且贡献了全球温室气体排放的18%和大气中37%的甲烷排放,这些值高于全球运输业。人造肉生产对环境的影响可能比传统农业小。特别是,减少温室气体排放将是人造肉生产的一个重要优势。人造肉生产的另一个潜在环境相关优势可能是与传统畜牧业相比土地使用较少,特别是在反刍动物的情况下。
1.1.3.动物福利和人造肉
最近,每年大约有560亿动物被屠宰以获取它们的肉。因此,传统畜牧业相关的动物福利是全球主要的伦理议程。人造肉生产系统被提出作为当前肉类生产系统的一个很好的替代品。人造肉可能是素食者、纯素者和因伦理原因拒绝肉类消费的人的一个有吸引力的选择。根据一篇先前的文章,我们可以预期广泛生产人造肉的以下效果:1)显著减少动物使用,2)大幅减少动物痛苦,3)多样化的人造肉来源,包括野生动物。
1.1.4.人造肉相关的消费者接受度和伦理问题
尽管人造肉在动物福利和环境方面具有潜在优势,但人造肉的商业成功在很大程度上取决于消费者感知和各种社会关切,包括自然性、食品安全和保障问题、框架效应、立法、宗教和伦理。因此,消费者对人造肉的接受度非常重要,但可能存在争议。最常见的人造肉障碍之一是其人工性质。消费者通常不容易接受新技术,如转基因生物,当他们对给定技术的信息有限时。此外,人造肉的框架效应对消费者对人造肉的态度、信仰和行为意图有显著贡献。然而,通过提供积极信息改变消费者感知可以使消费者尝试、购买和支付人造肉。因此,持续评估消费者感知随时间的变化是必要的。监管结构对于建立消费者对人造肉生产和人造肉本身的信任很重要,包括安全和营养成分。一些报告关注美国和欧盟的人造肉监管。然而,由于目前人造肉的不完整技术和信息不足,很难建立与人造肉相关的法规。
人造肉在几个宗教社群中存在争议,包括犹太人、穆斯林和印度教徒,因为它的地位不明确。在一项针对3030名参与者的人造肉相关消费者接受度调查中,包括犹太人、穆斯林和印度教徒,大多数参与者回应说他们愿意吃人造肉。然而,宗教义务,如饮食法规(犹太洁食、清真、印度教对牛肉的限制)仍需讨论。在食物选择的情况下,伦理问题变得越来越重要。尽管人造肉技术越来越接近实际商业可用性,但很明显人造肉的伦理问题尚未完全解决。消费者之间存在一些关于人造肉伦理问题的争论。支持者认为人造肉系统对肉类生产所需的动物数量大大少于传统畜牧业,并且可能有助于停止动物痛苦,例如在狭小空间中限制或在残酷条件下屠宰。此外,对那些出于伦理原因想要减少肉类消费的人,包括素食者和纯素者,人造肉可能是首选。根据一份先前的报告,人造肉可能对碳足迹产生积极影响,这使得提高人造肉意识成为一种潜在的有效策略。然而,尽管引入人造肉有潜在优势,许多人担心人造肉的食品安全问题,因为人们认为人造肉不自然。此外,一些人担心人造肉可能加剧富人和穷人之间的消费者不平等。
1.2.各种牲畜培养肉生产的生物学基础
全球目前存在32家培养肉公司,专注于培养牛肉(25%)、家禽(22%)、猪肉(19%)、海鲜(19%)以及其他异国肉类(15%),如鼠肉、袋鼠肉和马肉。这些公司大多位于北美(40%),其次是亚洲(31%)和欧洲(25%)。在过去5年中,大量资本被投入到培养肉相关的研究与开发中。据估计,约有3.2亿美元被投资于牛肉和猪肉(75%)以及海鲜生产(25%)。
卫星细胞最初由Richard Bischoff在1974年在体外分离(Bischoff,1974年)。自从发现肌肉卫星细胞分离和增殖方法以来,已经开发出各种修改后的协议,以更有效地从多种家畜中分离卫星细胞,如鸡、马、牛、羊、鱼和猪。利用分离的卫星细胞,研究人员能够进一步了解肌肉形成和发展的基本过程。最近,科学家们利用干细胞和肌肉培养技术,在实验室孵化器中使用分离的骨骼肌和卫星细胞开发出实验室培养的肉类。尽管尚未上市且比养殖肉类更昂贵,但培养肉比传统肉类具有多种优势。培养肉是一种清洁肉,没有可能的病原体,由于不需要大量空间来饲养家畜,因此对环境友好,并且与常规家畜养殖相比,全球气体排放显著减少。目前,世界各地出现了几家初创公司,正在进行生产高质量、低成本培养肉的研究(表2)。
1.2.2.鸡肉
Matsuda等人在1983年描述了鸡肌肉卫星细胞的体外分离和分化。Yablonka-Reuveni等人通过Percoll密度梯度离心分离得到的卫星细胞,获得了从卫星细胞分化的鸡胸肌细胞。卫星细胞在肉鸡孵化后肌肉生长、肌肉维护和肌肉损伤后的修复中发挥着关键作用。由于肌肉卫星细胞的干细胞特性,鸡卫星细胞的增殖和分化潜力已被详细评估。通常,当骨骼肌受损时,新的肌肉纤维来自预先存在的静止卫星细胞,取代受损区域并重建肌肉结构。Feldman和Stockdale等人建议,从快速肌肉(胸大肌)部分分离的鸡卫星细胞将只分化成快速纤维,而从慢速肌肉(前背阔肌)部分分离的卫星细胞大多分化成快速肌肉,但在较小程度上也能分化成慢速肌肉。
培养肉尚未正式商业化和销售,但许多公司已经将其推广为各种原型食品,如汉堡包、培根和鸡块。素食公司JUST在2018年通过宣传视频展示了人造鸡肉。他们展示了一段使用细胞培养创造的清洁鸡肉的视频。此外,JUST在2019年成功制造了一种细胞培养的鸡块产品,每个鸡块成本为50美元。食品技术公司Memphis Meats(加州伯克利,美国)在2016年发布了类似的宣传视频,介绍了培养肉产品的概念。次年,Memphis Meats成功制造并推出了一种培养鸡肉产品。Future Meat Technologies是一家成立于2018年、总部位于以色列的初创公司,也创造了细胞培养的鸡肉。该公司设法将生产成本降低到每磅鸡肉150美元。然而,即使是这些小食品,如人造鸡块,也需要美国食品药品监督管理局(FDA)和美国农业部(USDA)的批准。这些产品的商业化尚未实现。
1.2.3.鸭肉
在胚胎发育过程中,增殖的肌母细胞分化成肌管,然后进一步成熟和分化成成熟的肌肉纤维。Adal和Cheng早在1980年就研究了鸭肌肉细胞的结构,并表明鸭肌肉纺锤由几根肌肉纤维和一个包围它们的胶囊组成。1986年,据报道,鸭虹膜中的基质间充质细胞向虹膜肌肉迁移并成为虹膜骨骼肌。肌肉特异性微小RNA,称为MyomiRs,在肌肉细胞中表达,尽管它们也在其他几种组织中表达。Li等人在鸭胸肌中发现了279个新的微小RNA,表明微小RNA在肌肉发育和成熟中的重要性。其中,微小RNA-1和微小RNA-133被认为是鸭骨骼肌增殖和分化的关键因素。据报道,微小RNA-1通过靶向转录抑制因子组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)促进肌生成,而微小RNA-133通过抑制血清反应因子(SRF)和TGFBR1表达,增加肌母细胞增殖。
在鸭胚胎发育过程中,胸肌和腿部肌肉中的MyoD表达趋于逐渐增加,胸肌中的MyoD表达水平高于腿部肌肉。
然而,Li等人建议胸肌中的MyoD表达是一致的,但在早期胚胎发育期间腿部肌肉中减少。他们还表明MyoD和Myf6基因表达与腿部肌肉相关。然而,类胰岛素生长因子-1(IGF-1)诱导了MyoD和Myf5的表达,并增加了肌肉肥大。IGF-1已知能刺激骨骼肌。类似于培养鸡肉肉,Memphis Meats也生产了培养鸭肉,然后进行烹饪和展示,接着是产品品尝。此外,一家法国初创公司Gourmey能够培养鸭蛋细胞,通过略微调整营养物质来模仿填鸭的效果,以创造人造肥肝,他们称之为“道德肥肝”。在2020年,素食公司JUST成功地基于培养鸭细胞生产了鸭chorizo和pâté。
1.2.4.牛肉
牛肉已经被以各种方式研究了很长时间。肌肉的几个生物学方面已经被研究,以基本了解细胞增殖的机制,并且已经报告了许多与肉类动物肌肉发育和增殖相关的科学发现。在肉类动物中,肌肉发育的胎儿阶段至关重要,因为出生后肌肉纤维的数量不会改变。因此,产后肌肉通过增大肌肉纤维的大小来发育。位于肌肉纤维基底膜下的卫星细胞对于产后肌肉生长至关重要。主要的卫星细胞分化为肌源性谱系,但一小部分卫星细胞也可以分化为成纤维细胞或脂肪细胞,它们构成了骨骼肌组织。了解卫星细胞相关的肌肉生长和分化机制将使培养肉生产得到进一步改进。
控制营养物质补充和几个信号因子对于骨骼肌生长和大理石花纹很重要。例如,骨骼肌生长通过激活Wnt信号增强,而它抑制脂肪生成。由Wnt信号稳定β-catenin,正向调节肌源性基因,如Pax3、MyoD和Myf5。对于商业应用,大理石花纹可以通过在培养期间激活和抑制Wnt/β-catenin信号来控制,以生产更高质量的肉类。
Mosa Meat,一家荷兰初创公司,是第一个公开推广培养牛肉的公司。这种牛肉是通过培养和分化从牛身上获得的干细胞生成的,并被制成肌肉条。Mosa Meat在一次会议上烹饪了培养肉,然后组织了一个品尝派对。Mosa Meat现在创造了比以前更具成本效益的细胞培养肉,并且已经开发了一种无牛血清的培养基。Memphis Meats,一家总部位于加利福尼亚的初创公司,在2016年展示了第一个用细胞培养牛肉制成的肉丸。该公司目前正在建设一个培养牛肉和鸡肉的试验工厂。
1.2.5.猪肉
Doumit和Merkel建议猪肌源性卫星细胞可以从猪骨骼肌中分离出来,并为猪卫星细胞开发了一种优化的培养基。这种培养条件已经通过轻微的修改得到了改进。对于骨骼肌的体外培养,可以从肌肉组织中分离出卫星细胞或肌肉纤维以诱导生长和分化。Pax7是包括小鼠、人类、牛和猪在内的几种物种中功能性卫星细胞的关键标志。IGF-1也通过雷帕霉素(mTOR)途径影响猪卫星细胞。神经细胞黏附分子(NCAM),也称为CD56,和分化簇分子34(CD34)被建议作为猪骨骼肌中的肌源性细胞标志。乳酸脱氢酶A(LDHA)和衣壳蛋白复合体,β1亚单位(COPB1)也被认为参与猪肌肉发育。使用猪背最长肌进行的RNA-seq分析揭示了长非编码RNA参与肌肉生长和脂肪沉积。正如在小鼠中所示,卫星细胞的数量随着年龄的增长和长期培养而减少,这是由于它们失去了自我更新和分化潜力。
Meatable,一家荷兰初创公司,使用干细胞技术生产了细胞培养的猪肉,这使得公司能够轻松提取生产肉类所需的特定细胞类型。旧金山的另一家初创公司New Age Meats成功地从活体猪样本中生产了由脂肪和肌肉细胞培养制成的原型猪肉香肠。
1.3.培养肉生产的技术方法
基于组织工程的培养肉生产主要依赖于大规模细胞培养技术,这些技术能够提供大量的细胞,从而实现肉类生产。大规模细胞生产系统还旨在使用最少的所需资源生产尽可能多的细胞。最小化处理和为足够数量的收获细胞提供短暂的培养周期也是通常被认为是高效细胞质量生产的因素。几种细胞类型可能是培养肉生产的可行选择,包括肌源性卫星细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞(iPS)细胞。在这些不同的细胞类型中,肌源性卫星细胞被广泛用作有前途的选择,因为它们能够有效地分化成肌管。使用多种方法和生物反应器来扩增锚定依赖性细胞。每种技术都有其自身的优点,但通常,这些平台为细胞提供了附着表面积,同时确保气体和营养物质的交换。
1.3.1.多托盘系统
由于细胞培养是培养肉生产的主要步骤,选择合适的培养皿或容器至关重要。细胞培养中常用的T型烧瓶提供的表面积为20-225平方厘米。对于需要比这更大的表面积的大规模培养,可以使用多个T型烧瓶。作为替代方案,已经开发了一种在单一单元内提供高表面积的多托盘系统。尽管这个系统有多个托盘提供多个细胞附着表面,但处理多个T型烧瓶可能是劳动密集型的,因为每个T型烧瓶都必须单独管理。
1.3.2.滚筒瓶
滚筒瓶由Gey在1933年设计,旨在在减少培养基使用的同时,低成本维持大量细胞群体。放置在密封气体室或没有气体室的箱子中的滚筒瓶可以密封,以防细胞和培养基干燥。这个系统还需要一个慢速驱动机制,使带有细胞的瓶子缓慢旋转,使培养基均匀覆盖细胞,并允许更多的气体交换。滚筒瓶可以提供高达350,000平方厘米的表面附着面积。与T型烧瓶或多托盘培养相比,滚筒瓶为锚定提供了更优越的应用。然而,滚筒瓶系统的实时监测困难,同时处理多个滚筒瓶是费力的。为了克服这些缺点,已经做出了相关努力来自动化基于滚筒瓶的培养过程。滚筒瓶已被用于大规模培养鸡肉细胞,这可能被应用于鸡肉生产。根据美国农业部的数据,滚筒瓶孵化器系统极大地提高了猪肌肉细胞的生产输出,为体外肉工程的细胞片三维(3D)制造提供了足够的细胞。
1.3.3.微载体
悬浮培养细胞比单层培养系统提供更多的产出,但对于锚定依赖性细胞来说,附着在特定的培养表面上是增殖而不失去其细胞特性的关键。为了大规模培养锚定依赖性细胞,微载体被用来建立悬浮培养。1967年,Van Wezel描述了使用右旋糖酐颗粒开发大规模细胞培养的“微载体”概念。这些右旋糖酐颗粒是微米大小的珠子,显示出正电荷表面,并吸引含有负电荷膜的动物细胞。可以使用多种材料作为微载体,包括右旋糖酐、纤维素、明胶和塑料。这些微载体可能是实心的或多孔的,可以根据培养意图和细胞类型选择材料。在微载体用于可食用肉的生产时,应考虑食品合规性。尽管一些研究人员已经专注于开发适合人类干细胞的微载体,但用于肌细胞扩增或培养肉生产的微载体尚未开发。从微载体中分离培养细胞是最后一步,其中培养细胞用于后续应用。微载体可以通过使用酶或机械力从培养细胞中分离出来,这是一个具有挑战性的程序。由热响应材料制成的微载体可以根据温度依赖性改变其表面特性并脱落附着的细胞,然后可以进行过滤。可生物降解的微载体也被广泛使用,因为它们不需要繁琐的收获程序。各种可食用的聚合物和水凝胶可以作为可食用微载体的基础。可食用微载体可能不需要细胞解离步骤,因为整个结构适合食用。肌源性卫星细胞可以在悬浮培养中使用可生物降解或可食用的微载体。最近,卫星细胞已经在使用可生物降解支架的悬浮培养系统中生长和分化,用于培养肉的发展。这个过程需要细胞锚定在支架表面,这可以由组织工程构建提供。
1.3.4.支架
从肌肉细胞中获得组织结构是创造培养肉的有效方式。然而,通常在培养皿中培养细胞以获得类似组织的构造是非常具有挑战性的。为了使细胞形成适当的结构,使用支架。成型成理想形状的支架可以为肌肉细胞锚定提供物理支持。细胞高度依赖于生态位,支架旨在为细胞提供类似于生态位的环境以促进生长。水凝胶通常用作支架基础材料,以模仿细胞生态位。工程化的多孔水凝胶模仿细胞外基质(ECM),因为它为细胞提供了适合水、气体和营养物质交换的通透锚定。这种3D支架可以通过简单地将细胞播种到成品结构上,或者将细胞混合到生物墨水中并3D打印细胞包裹混合物以形成充满细胞的支架。用于组织工程的几种类型的基础材料。胶原蛋白、纤维蛋白和海藻酸盐被用作水凝胶,但为了使凝胶更生物学地类似于实际组织,引入了使用去细胞细胞外基质(dECM)的生物墨水。与一般水凝胶相比,由dECM制成的生物墨水包含更多的组织特异性因子,包括生长因子、粘附蛋白,被认为更适合组织工程。尽管没有报告通过支架细胞生产培养肉的案例,但研究表明,充满细胞的3D打印结构可以用于组织移植,肌细胞也能够被3D打印和培养。去细胞植物组织用于3D纤维素支架也是可用的。植物组织丰富、易于获得且经济便宜。在去细胞植物支架上培养肌肉细胞可以刺激生长、增殖和分化,同时由于天然植物纤维素模式提供肌管对齐。
培养肉的最终目标是在不直接涉及动物的情况下生产可食用的肉制品,而不是获取和增殖从家畜身上取得的肉。为此,多能干细胞可能是最佳选择,因为它们可以分化成肌肉、脂肪和其他细胞类型,增强真正的肉味。在两种多能干细胞类型中,胚胎干细胞和诱导多能干细胞(分别为ESCs和iPSCs),iPSCs似乎更适合,因为它们易于建立,并提供了非胚胎基础的替代方案。迄今为止,已经建立了来自各种家畜的iPSCs,包括牛、猪和鸡。尽管人类和小鼠iPSCs表现出无限的自我更新潜力,但在家畜iPS细胞在当前培养系统中长期培养期间会失去干性。因此,应该改进培养基,以实现家畜iPSC的长期培养。
由于肌肉组织是由多种不同细胞类型组成的复杂结构,应建立可靠的肌肉、脂肪、肌红蛋白等分化方案,以及形成多种细胞类型的3D结构的技术(图2)。利用组织工程技术或生物打印系统,肌肉细胞和各种支持细胞类型可以在同一个3D支架上培养,形成模仿体内骨骼肌结构的复杂组织。最近,3D工程支架被用于牛卫星细胞,它们通过将它们浸入肌源性生长介质中,在3D支架上增殖。牛平滑肌细胞和内皮细胞在支架上分化,形成基于细胞的肉制品,据报道适合作为食品消费。
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