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“ABBS生物化学与生物物理学报”
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导 读
噬菌体具有广泛的应用场景，如用于疫苗载体、基因治疗载体和对抗抗生素耐药性细菌等。用于上述情况的理想噬菌体应具有一系列特征，如稳定性强、特异性强、不产生对人体有害的物质等。这些特征的实现依赖于例如CRISPR/Cas9的高效基因组编辑工具。然而，在实际的基因编辑过程中，有部分噬菌体会逃逸CRISPR/Cas9系统的切割，这些逃逸的噬菌体被称为逃逸子，逃逸子的出现不仅降低了噬菌体基因组编辑系统的效率，同时也阻碍了CRISPR/Cas9在噬菌体工程化领域的深入应用。因此，解析噬菌体逃逸CRISPR/Cas9切割的机制，有助于开发高效的噬菌体基因组编辑工具，并加速工程化噬菌体的构建。近期，四川师范大学生命科学学院李琦等人揭示T7噬菌体逃逸CRISPR/Cas9切割的原因，并制定了提高噬菌体基因编辑效率的策略。2024年5月17日，他们在Acta Biochimica et Biophysica Sinica期刊在线发表题为“Increasing CRISPR-Cas9-mediated gene editing efficiency in T7 phage by reducing the escape rate based on insight into the survival mechanism”的研究论文。
为探究T7噬菌体逃逸Cas9切割的主要原因，该研究首先针对必需基因5以及非必需基因1.3、1.2和1.7，设计向导RNA引导Cas9去切割，测定各位点的逃逸率并对逃逸子中靶基因进行PCR扩增和测序。结果发现T7噬菌体在不同切割位点都存在逃逸Cas9切割现象，其中非必需基因处的逃逸率在10-2-10-3之间，必需基因处的逃逸率则为10-6左右。靶基因的测序结果显示，T7噬菌体逃逸Cas9切割的主要原因是靶基因发生突变，突变类型主要包括点突变及微同源末端连接（microhomology-mediated end-joining, MMEJ）导致的DNA片段缺失（图1）。
图1. T7噬菌体逃逸CRISPR/Cas9切割的原因分析
由于靶标基因中存在多对可能导致MMEJ发生的重复序列，为确认T7噬菌体在选择这些不同的重复序列时是否存在偏好性，研究人员将携带16对不同重复序列的非必需基因4.3作为测试靶点，并将切割位点设计在所有重复序列之间，在该基因切割后随机挑取10个逃逸子进行后续研究。发现其中9个逃逸子通过同一种重复序列产生MMEJ事件，剩余1个逃逸子则是靶基因发生了点突变，说明在该位点存在一个供MMEJ事件发生的热点区。基于此，研究人员将切割位点设计在热点DNA区域外，发现T7噬菌体的逃逸率可从7.1×10-2降低至2.2×10-6，进一步对逃逸子进行测序，没有观察到MMEJ现象；并基于该切割位点对4.3基因（0.2 kb）进行敲除，该基因的敲除效率从20%提高到100%（图2）。
图2. 巧妙设计gRNA可降低MMEJ发生频率并提高基因敲除效率
为探究T7噬菌体中参与MMEJ发生的基因，研究人员经过文献查阅并分析MMEJ过程，最终锁定了T7噬菌体的ATP依赖性DNA连接酶（编码基因为1.3）。研究人员对该基因进行了敲除，并比较了野生型T7和T7 Δ1.3在同一切割位点下的逃逸率及发生MMEJ的频率。发现敲除1.3基因能使T7噬菌体在Cas9切割下的逃逸率由7.1×10-2下降到4.29×10-3。此外，每组随机挑取10个逃逸子分析MMEJ事件，发现T7 Δ1.3中仅有2个逃逸子是通过MMEJ途径产生的，而在野生型T7噬菌体中则有8个逃逸子发生了MMEJ事件（图3）。
图3. 敲除1.3基因可以降低T7噬菌体MMEJ发生频率
在证明T7噬菌体中1.3基因的敲除可以降低MMEJ的频率后，研究人员期望通过降低逃逸率来提高CRISPR/Cas9的编辑效率。因此，他们尝试在T7 Δ1.3中敲除4.3（0.2 kb）和1.7（0.6 kb）两个基因，以野生型T7噬菌体作为对照。结果显示，T7 Δ1.3中4.3和1.7的基因敲除效率均为100%，而在野生型T7中这两个基因的敲除效率仅为20%和10%（图4）。
图4. 敲除1.3基因可以提升T7噬菌体基因敲除效率
本研究表明，T7噬菌体主要通过靶基因突变逃逸Cas9的切割，突变类型为点突变及MMEJ导致的DNA片段缺失。关于MMEJ事件：研究人员通过巧妙设计gRNA来避免逃逸的发生进而降低逃逸率、提高基因编辑效率；并从T7噬菌体自身的角度揭示了1.3基因在MMEJ事件中发挥作用，敲除1.3基因可降低逃逸率并提高基因编辑效率。本研究揭示了T7噬菌体逃逸CRISPR/Cas9切割的原因，并根据原因制定了降低逃逸率、提高基因编辑效率的策略，该研究将可促进对噬菌体的研究。
Increasing CRISPR/Cas9-mediated gene editing efficiency in T7 phage by reducing the escape rate based on insight into the survival mechanism
Mingjun Sun1, Jie Gao1, Hongjie Tang1, Ting Wu1, Qinqin Ma1, Suyi Zhang2,3, Yong Zuo1, Qi Li1,*
1College of Life Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, China, 2Luzhou Laojiao Co, Ltd, Luzhou 646000, China, and 3National Engineering Research Center of Solid-State Brewing, Luzhou 646000, China
通讯作者
李琦，博士、副教授、硕士生导师。现主持四川省自然科学基金面上项目、四川省自然科学基金青年项目等。从事微生物遗传与基因编辑方面的研究，以通讯/第一作者身份在ACS Synthetic Biology、Biotechnology Journal、Biotechnology and Bioengineering等杂志上发表相关研究论文10多篇。四川省科技青年联合会理事。
THE END
ABBS《生物化学与生物物理学报》，1958年创刊，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）主办，主编丁建平研究员。本刊为完全开放获取（OPEN ACCESS）期刊。出版生物化学、分子生物学、生物物理学的综述、论文和简讯。入选中国科技期刊卓越行动计划梯队期刊类项目。JCR IF为3.7，生物化学与分子生物学领域Q3，生物物理学领域Q2。中科院期刊分区表生物学2区。
审核 徐明华/徐文琳
编辑 寿彩华/郑福军 美工 寿彩华
编辑部 abbs@sibs.ac.cn
