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“ABBS生物化学与生物物理学报”
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导 读
DNA复制应激是引起自发性DNA损伤和基因组不稳定的主要原因。虽然已知p53缺失会引起DNA复制应激，但其具体的分子机制尚不明了。南昌大学第一附属医院江西省呼吸疾病研究所徐新平、李晓蕾团队发现p53缺失引起R-loop形成增加是导致DNA复制应激的主要原因，而核糖核苷酸还原酶（RNR）上调促进了该过程的发生。研究表明，p53缺失导致γH2AX表达增加和HPRT基因突变率升高以及R-loop形成增多，而这些效应可通过mTORC1的抑制剂雷帕霉素得到缓解。p53缺失引起的DNA复制应激依赖于mTORC1的激活，RNR上调和R-loop增多与mTORC1激活相关。本研究揭示了R-loop在mTORC1激活依赖性DNA复制应激中的作用。2024年11月4日，该团队在Acta Biochimica et Biophysica Sinica期刊在线发表题为“R-loop formation contributes to mTORC1 activation-dependent DNA replication stress induced by p53 deficiency”的研究论文。
该团队利用CRISPR-Cas9技术在HCT116和mNS-5细胞系中成功构建了p53基因敲除（KO）模型，并通过Western blot和免疫荧光染色验证了p53的敲除效率（图1）。结果显示，与p53野生型（WT）细胞相比，p53 KO细胞的细胞核大小呈现异质性，其中部分细胞核明显增大（图2A-B）。据此推测，p53 KO细胞中观察到的细胞核增大可能与DNA复制相关。通过免疫染色发现，p53 KO细胞中的γH2AX foci显著增加，而且集中在较大的细胞核内（图3B）。通过γH2AX与EdU 共同标记，进一步确认这些DNA损伤发生在细胞周期的S期（图2C、D）。使用HRPT报告基因系统评估基因组稳定性，发现p53 KO细胞中的HPRT突变频率为1.16/10⁶个细胞，而p53 WT细胞为0.31/10⁶个细胞，表明p53缺失显著增加了基因突变负荷（图2E）。为验证γH2AX的增加与p53缺失的相关性，在p53KO细胞中重新表达p53。结果显示，恢复p53表达后，升高的γH2AX得了缓解（图2F）。以上表明p53缺失导致DNA损伤和基因组不稳定性，进而引发DNA复制应激。
图1. 利用CRISPR-Cas9构建p53敲除细胞系
图2. p53缺失引起DNA复制应激
图3. p53缺失引起γH2AX和53BP1表达升高
与p53野生型（WT）细胞相比，p53-KO细胞中p70S6K1和pS6RP水平升高，而4EBP1水平下降（图4A）。在p53-KO细胞中重新表达p53后，p70S6K1和pS6RP的水平被抑制（图4A、图5B）。结果表明，p53缺失导致mTORC1在p53KO细胞中过度激活。对HCT116 p53 WT和p53 KO细胞使用不同浓度雷帕霉素处理，结果显示雷帕霉素可以缓解p53 KO细胞中细胞核增大的现象（图4C），并下调γH2AX的表达（图4B）。随着雷帕霉素处理时间的延长，γH2AX的水平也逐渐降低（图4B）。在48小时雷帕霉素处理后，p53 KO细胞中γH2AX与EdU的共定位率从65.66%降至26.85%（图4F, G）。雷帕霉素还减少了p53 KO细胞中HPRT基因突变的频率（图4D, E）。结果表明，抑制mTORC1能够缓解p53缺失引起的DNA损伤和基因组不稳定性，进一步支持p53缺失引起的DNA复制应激与mTORC1过度激活之间的关联。
图4. p53缺失引起DNA复制应激与mTORC1激活相关
图5. p53KO细胞中重新表达p53可抑制mTORC1信号通路
研究者观察到，与p53野生型（WT）细胞相比，p53 KO细胞中TOPIIα（TOP2A）、BRD4、RNase H1和RPA的表达水平显著升高（图6C）。多柔比星（Dox）（浓度为0.1 μM）显著提高了p53 WT和p53 KO细胞中Top2A、BRD4、RNase H1和pRPA/PRA的水平。在p53-KO细胞中，这些蛋白质水平的增加发生得比p53 WT细胞更早（图6C）。发现表明，p53缺失可能导致细胞面临更多的拓扑冲突，从而加剧DNA损伤和复制应激。研究者通过S9.6染色检测了转录-复制冲突引发的R-loop结构。发现p53 KO细胞中S9.6 foci的数量显著高于p53 WT细胞（图6D、E）。结果表明，p53 KO细胞中R-loop结构的显著增加，且可能是导致复制应激加剧的原因之一。
图6. p53缺失引起DNA复制应激由转录复制冲突增加引起
在多柔比星（Dox）处理后，p53 WT和p53 KO细胞中对Top2A、RNase H1、BRD4和RPA的需求均有所增加（图6C）。此外，p53 KO细胞中的pS6RP水平显著升高，但p53 WT细胞中未见明显变化（图7A）。结果表明，随着拓扑冲突的增加，mTORC1被激活。研究者还发现，在p53-KO细胞中，RRM1和RRM2的表达上调（图7B），这与S6RP的磷酸化增加一致。雷帕霉素处理后，RRM1和RRM2的水平显著下调（图7B）。并且在雷帕霉素处理的p53-KO HCT116细胞中S9.6 foci数量显著减少（图7C、D、附图S5），表明雷帕霉素可缓解p53缺失引发的R-loop形成。这些发现表明，p53 KO细胞中R-loop的增加与mTORC1的激活密切相关，而这一过程可能通过RNR上调机制介导。但表明R-loop的增加与mTORC1激活的直接证据仍需进一步研究。
p53缺失导致的DNA复制应激依赖于mTORC1的激活，从而促进了更多R-loop结构的形成，导致了DNA损伤及复制应激。该研究为揭示p53抑制肿瘤发生的机制提供了新的见解，并为雷帕霉素在癌症治疗的新应用提供了支持。
R-loop formation contributes to mTORC1 activation-dependent DNA replication stress induced by p53 deficiency
Xiaolei Li1,4,*, Cheng Yang1,2, Xiaohui Zhang1,3, Feiyang Wang2, Longhua Sun1,4, Wei Zhang1,4, Xinping Xu1,4,*
1Jiangxi Provincial Key Laboratory of Respiratory Diseases, Jiangxi Institute of Respiratory Disease, Department of Respiratory and Critical Care Medicine, the First Affiliated Hospital, Jiangxi Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China, 2Jiangxi Medical College, First Clinical Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China, 3Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Renmin Hospital of Shangrao, Shangrao 334000, China, and 4China-Japan Friendship Jiangxi Hospital, National Regional Center for Respiratory Medicine, Nanchang 330200, China
徐新平，博士，研究员，南昌大学第一附属医院江西省呼吸疾病研究所副所长；研究领域为呼吸相关疾病的发病机理，迄今为止，以第一作者和通讯作者发表SCI文章40余篇；申请专利3项；获江西省科技技术进步一等奖2项；目前作为Faculty 1000评论员、杂志审稿人、特邀编辑、学会会员等。多次被邀请在国际性学术会议中作学术报告。主持国家级课题4项；主持江西省高层次人才青年项目与江西省科技厅重点项目等。
李晓蕾，医学博士，副研究员，硕士生导师。主要从事DNA损伤修复与肺癌治疗抵抗方面的研究。在Nature Communications，Genes & Disease，Cancer Letter等期刊发表论文10余篇，主持/参与国家自然科学基金项目、江西省自然科学基金青年项目与面上项目等。
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审核 徐明华/徐文琳
编辑 寿彩华/郑福军/蔡花漫 美工 寿彩华
编辑部 abbs@sibs.ac.cn
