四川大学刘肖珩团队：绿茶多酚EGCG通过调控JunB抑制慢性肾病相关血管中膜钙化

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慢性肾病相关的血管中膜主动脉钙化（MAC）会增加血管壁僵硬度、诱发心肌缺血和心力衰竭，增加了心血管疾病的发病率和死亡率。目前对于MAC还缺乏有效的治疗药物，它一旦发生就很难逆转。最近，四川大学刘肖珩团队发现绿茶中主要多酚类化合物EGCG具有抑制慢性肾病相关的MAC作用。研究团队发现，EGCG显著减少慢性肾病小鼠主动脉和高磷高钙诱导的人主动脉血管平滑肌细胞（HASMCs）矿物质沉积、抑制血管平滑肌细胞（VSMCs）的成骨分化。此外，借助RNA-seq分析，研究团队发现转录因子JunB是促进MAC的关键因子，EGCG通过失活JunB发挥抑制MAC的作用。2024年6月3日，该团队在Acta Biochimica et Biophysica Sinica期刊在线发表题为“Epigallocatechin-3-gallate inhibits osteogenic differentiation of vascular smooth muscle cells through the transcription factor JunB”的研究论文。

研究人员使用5/6肾脏切除加高磷饮食诱导的方法构建小鼠慢性肾病相关的MAC模型，并同时使用不同剂量的EGCG（25 mg/kg/day和50 mg/kg/day）灌胃治疗8周。首先，研究人员探究了EGCG对小鼠主动脉矿物质沉积的影响。小鼠主动脉的大体茜素红染色、主动脉钙含量分析、小鼠腹主动脉切片的茜素红和Von Kossa染色结果显示在体内水平EGCG显著抑制CKD小鼠主动脉矿物质沉积（图1）。

图1. EGCG减少CKD小鼠主动脉矿物质沉积

接着研究人员用免疫荧光的方法检测小鼠腹主动脉切片中VSMCs成骨分化相关蛋白（α-SMA、SM-MHC、MMP2、MMP9、ALP和Runx2）的表达。结果显示，EGCG能够上调VSMCs收缩型蛋白α-SMA和SM-MHC表达，下调成骨分化相关蛋白MMP2、MMP9和ALP表达，抑制Runx2的核转录。此外，对小鼠主动脉组织的western blot结果显示，EGCG显著逆转小鼠主动脉中钙化相关蛋白的表达。这些结果说明EGCG可抑制CKD小鼠主动脉中VSMCs的成骨分化（图2）。

图2. EGCG抑制CKD小鼠主动脉VSMCs成骨分化

研究人员使用10 mM β-GP和3 mM CaCl₂诱导HASMCs钙化，并同时给予不同浓度的EGCG共处理。细胞的茜素红染色、钙含量和ALP活性检测结果显示EGCG显著抑制高磷高钙诱导HASMCs的钙盐沉积。此外，免疫荧光染色和western blot结果显示EGCG显著逆转血管钙化相关蛋白的表达和分布，上调α-SMA和SM-MHC的表达，下调成骨分化相关的MMP2、MMP9和ALP，降低Runx2的核转录。此外，qRT-PCR 结果也提示，EGCG可提高不同钙化阶段HASMCs中α-SMA的mRNA表达，降低ALP和Runx2的表达。这些结果表明，在体外水平EGCG能够抑制HASMCs的钙化（图3）。

图3.  在体外水平EGCG抑制HASMCs矿物质沉积和成骨分化

为了探究EGCG调控MAC的分子机制，研究者们借助RNA-seq分析，发现补充EGCG后AP-1家族成员之一的转录因子JunB显著下调。研究者们将重点聚焦到JunB，并在体内和体外水平验证EGCG对JunB表达和转录的影响。western blot的结果显示，低剂量和高剂量的EGCG均能显著减少CKD小鼠主动脉中JunB的表达。同时，免疫荧光染色结果也证实，给予EGCG可明显降低小鼠主动脉中JunB的表达和核转录水平。此外，免疫荧光染色也表明，EGCG处理可显著减少高磷高钙诱导的HASMCs中JunB的核转录和磷酸化JunB（p-JunB）的表达。Western blot的结果也进一步证实，EGCG处理可改变细胞质和细胞核中JunB和p-JunB的表达，EGCG显著下调胞核中JunB和p-JunB 的表达（图4）。 

图4. 在体内外水平EGCG 抑制JunB的活化

为了确定JunB在EGCG抑制MAC中的作用，研究者们通过构建了过表达和敲除JunB的HASMCs，来探究干扰JunB的表达是否会影响HASMCs的钙化。钙含量和ALP活性的检测结果表明，过表达JunB明显阻断了EGCG对HASMCs钙化的抑制作用，在促钙化条件下HASMCs中矿物质的沉积和ALP活性进一步增加。此外，过表达JunB会上调ALP和Runx2的蛋白表达，并降低α-SMA的表达。然而，敲除JunB可增强EGCG对HASMCs钙化的抑制作用。此外，研究者们还探究了EGCG对HASMCs增殖的影响。EdU染色显示，EGCG能显著减少过表达和敲除JunB的HASMCs增殖（图5）。

图5. EGCG 通过下调 JunB的表达改善 MAC

KEGG通路分析表明，EGCG可调节MAPK信号通路。研究者们用western blot检测了Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路标志的关键蛋白Ras、MEK和ERK的表达。结果显示， 在CKD小鼠主动脉中Ras、p-MEK 和p-ERK的表达量明显增加，而给予EGCG干预后，EGCG能显著降低这些蛋白的表达。此外，为了更好地探究EGCG对该通路的调控作用，研究者们使用了该信号通路的一个经典的抑制剂PD98059。体外研究证实，在促钙化条件下，EGCG和PD98059可抑制HASMCs 中的Ras/Raf/MEK/ERK信号通路关键蛋白的表达。随后，研究者们进一步探讨了Ras/Raf/MEK/ERK信号通路在EGCG介导的MAC抑制中的作用。茜素红染色和western blot的结果显示，PD98059联合EGCG可显著增强EGCG对HASMCs矿物质沉积和成骨分化的抑制作用。此外，EGCG与PD98059联合处理可显著减少HASMCs的迁移和增殖。这些结果表明，在体内和体外水平EGCG通过失活Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路来改善 MAC（图6）｡

图6. EGCG 通过失活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路改善MAC

为了进一步探讨JunB和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路在EGCG抑制MAC过程中的关系，研究者们将Ras/Raf/MEK/ERK信号通路抑制剂（PD98059和索拉非尼）和EGCG共处理HASMCs。在促钙化条件下，抑制剂和 EGCG 共处理能进一步降低HASMCs中JunB的表达。此外，western blot和免疫荧光检测结果显示，补充抑制剂可降低细胞质中JunB 的表达，减少JunB的核转位，并降低细胞核中p-JunB的表达。有趣的是，茜素红染色、钙含量和ALP活性测定结果显示，MAPK通路抑制剂能减轻JunB介导的HASMCs钙化。这表明，Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路的失活可以抑制JunB的核转位，阻止JunB介导的钙化。以上这些结果表明，Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路参与EGCG介导的 JunB失活（图7）。

图7. Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与EGCG介导的JunB失活

这项研究表明转录因子JunB是促进钙化的关键分子，EGCG通过失活JunB在体内和体外水平发挥抑制CKD相关MAC的作用。这项研究结果阐明EGCG抑制CKD相关MAC的机制，为EGCG的临床转化应用提供了参考。可以通过饮食干预或药物疗法来提高机体EGCG的水平。假设一杯冲泡的绿茶（240 mL）中含有200 mg至300 mg的EGCG，流行病学研究表明，每天饮用3~4 杯以上的绿茶可降低罹患心血管疾病和全因死亡的风险。这项研究也提示，每天喝几杯绿茶或服用类似剂量的EGCG片剂可以降低血管中膜钙化的风险。

Epigallocatechin-3-gallate inhibits osteogenic differentiation of vascular smooth muscle cells through the transcription factor JunB

Tiantian Li¹, Fei Fang¹, Hongmei Yin², Zhen Zhang³, Xiangxiu Wang^4,5, Erxiang Wang¹, Hongchi Yu¹, Yang Shen¹, Guixue Wang^4,5,*, Weihong He^6,*, Xiaoheng Liu^1,3,*

¹Institute of Biomedical Engineering, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China, ²West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China, ³Department of Cardiology, the Third People’s Hospital of Chengdu, Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University, Chengdu 610000, China, ⁴Key Laboratory for Biorheological Science and Technology of Ministry of Education, State and Local Joint Engineering Laboratory for Vascular Implants, Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400030, China, ⁵JinFeng Laboratory, Chongqing 401329, China, ⁶Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, China

通讯作者

王贵学，重庆大学生物工程学院教授，博士研究生导师。重庆大学生物工程学院院长，重庆大学现代生命科学实验中心、应用生物技术研究中心负责人、重庆市血管植入物工程实验室、国家生物产业基地公共实验中心（重庆）主任、血管植入物国家地方联合工程实验室主任。参与和主持了国家 “十二五”科技支撑计划重点项目、国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金项目、国家高技术产业化重大专项、参与国家973计划与国家重大科学研究计划项目子课题2项，支撑计划子课题1项。公开发表论文 190多篇，被SCI/EI收录100余篇次。担任中国动脉硬化杂志常务编委，J Med Biol Eng，AIMS Bioeng，J Cardiol Therapy等国际杂志编委。Biomaterials, J Biomech, Ann Biomed Eng, J R Soc Interface, Crit Rev Biotechnol, Nanomed-Nanotechnol, J Control Release，Cytotechnology，Mat Sci Eng C-Mater, J Biomed Mater Res B等国际杂志审稿人；应用生物力学杂志特约审稿人。

何威宏，四川大学华西基础医学与法医学院副研究员。临床医学MD博士及心脏研究PhD博士，现任生理学教研室副研究员。2012年毕业于四川大学临床医学（八年制）专业；2012年至2017年留学英国格拉斯哥大学英国心脏基金会格拉斯哥心血管研究中心，获得PhD博士学位。从事心脏研究，研究成果发表Circulation、Cardiovascular Research等心血管领域著名期刊。主持四川省科技计划重点研发项目等课题。

刘肖珩，四川大学华西基础医学与法医学院学院教授，博士研究生导师，四川大学生物医学工程学科带头人、华西基础医学与法医学院副院长。法国国家科研中心（CNRS）和法国Nancy第一大学（Universitéde Nancy 1）博士后。中国力学学会/中国生物医学工程学会生物力学专业委员会委员，中国生理学会血液流变学专业委员会常务委员，中国生物材料学会力学生物学专业委员会委员，国际生物材料学会、世界华人生物医学工程学会会员。主持国家自然科学基金重点项目1项、国家自然科学基金面上项目8项，主持省部级课题8项，发表学术论文130余篇，获得国家发明专利5项，四川省教学成果一等奖和全军科技进步三等奖各1项。《生物医学工程学杂志》、《生物医学》编委，国家自然科学奖评审专家、国家自然科学基金评审专家，Biophysical Journal、Journal of Biomechanics、《中国生物医学工程学报》、《生物医学工程学杂志》等杂志审稿人。