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“ABBS生物化学与生物物理学报”
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导 读
酒精性肝病（ALD）是一种常见的肝病，主要由于长期大量饮酒导致，严重危害人民健康。然而由于缺乏理想的疾病模型，其研究进展比较缓慢。近年来出现的类器官以其具有接近人体生理状态的细胞构成和与原组织或原器官类似的三维组织结构的特点，很快成为了临床和实验室研究的热点。由于类器官可以在体外长期培养扩增并能保持稳定的遗传特性，为疾病模型的构建、治疗药物的筛选及组织器官发育的研究提供了理想的平台，也为解决肝脏疾病模型的问题提供了可能。山西医科大学出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室解军团队在Acta Biochimica et Biophysica Sinica期刊发表了题为 “Development of an alcoholic liver disease model for drug evaluation from human induced pluripotent stem cell derived liver organoids”的研究论文，报道了一种全新的用于酒精性肝病研究的肝脏类器官模型。
研究人员通过特定的细胞培养基与细胞因子和小分子化合物组合先将人诱导多能干细胞经历定向内胚层分化为前肠细胞，随后将前肠细胞植入基质胶中进行三维培养，进一步分化形成了包括由肝祖细胞构成的球形细胞团和由间质细胞构成的不规则细胞团的肝脏类器官（图1）。
图1. 肝脏类器官生成示意图
通过对肝脏类器官的石蜡切片进行免疫荧光染色，证实肝脏类器官中的球形细胞团是由具有极性上皮结构的上皮细胞（肝细胞和胆管细胞）组成的中空囊状类器官（图2A）。此外，散布在球形结构周围的不规则细胞簇表达肝星状细胞特异性蛋白质波形蛋白（VIM）和结蛋白（DES），以及库普弗细胞标志物CD68（图2B）。流式细胞术证实肝脏类器官中存在表达CD68+、CK19+、AAT1+和VIM+的细胞群（图2C）。蛋白质免疫印迹实验也在肝脏类器官的蛋白质提取物中检测到有AAT1，CK19，VIM和CD68存在。这些结果表明，除了能够分化为肝细胞和胆管细胞的肝祖细胞外，肝脏类器官还含有肝星状细胞和库普弗细胞成分。
图2. 肝脏类器官的结构和细胞成分鉴定
通过免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹实验来检测肝脏类器官中肝脏特异性蛋白的表达。结果表明，肝脏类器官中存在肝脏特异性蛋白质，包括肝细胞核因子4（HNF4α）、白蛋白（ALB）、α1-抗胰蛋白酶（AAT1）、细胞角蛋白18（CK18）、乙醇脱氢酶（ADH）、碱性磷酸酶（ALP）和细胞色素P450家族成员2E1（CYP2E1）（图3A、B）。过碘酸希夫染色（PAS）证实肝脏类器官中的肝细胞可以合成并储存糖原（图3C）。吲哚菁绿（ICG）摄取和释放试验证实肝脏类器官中存在具有ICG摄取和排泄能力的功能性肝细胞（图3D）。
图3. 肝脏类器官中肝细胞特异性蛋白质和肝脏功能鉴定
通过在培养基中添加一定浓度的乙醇，对获得的肝脏类器官进行乙醇处理建立了ALD的肝脏类器官模型。通过荧光定量PCR反应检测到乙醇处理后肝脏类器官中与肝脏物质代谢、脂质代谢、纤维化以及炎性因子相关的基因表达发生了改变（图4）。通过BODIPY染色证实ALD类器官模型细胞中有脂质堆积；通过线粒体膜电位测试证实ALD类器官模型细胞中线粒体膜电位降低；通过活性氧检测证实ALD类器官模型细胞中活性氧水平升高；通过Calcein/PI染色证实ALD类器官模型细胞中细胞活性显著下降；天狼猩红染色和Masson染色显示经过乙醇处理后肝脏类器官中胶原含量增加（图5）。
图4. ALD肝脏类器官模型中的基因表达
图5. ALD类器官模型中的病理特征
最后，分别用高、中、低三个不同浓度的IL-22、美他多辛和N-乙酰半胱氨酸对用100mM乙醇处理建立的ALD肝脏类器官疾病模型进行治疗，72h后检测细胞活力来测试这三种药物的作用。结果显示这三种药物治疗组肝脏类器官中的细胞活力均高于未治疗组肝脏类器官，说明这三种药物可以缓解乙醇处理对肝脏类器官的损伤作用，对酒精性肝病有预防和治疗作用（图6）。也证实ALD类器官模型可以作为临床上治疗ALD的药物筛选平台。
图6. ALD模型的药物测试
该究成功从人诱导多能干细胞中生成了肝脏类器官，并建立了ALD的肝脏类器官疾病模型。该模型重现了ALD的一些病理特征，比如肝细胞内脂质堆积，线粒体膜电位损伤，细胞内活性氧浓度增高，炎性因子分泌增加以及胶原分泌增加等。通过添加药物对该ALD肝脏类器官模型进行治疗，证实该类器官疾病模型可以作为临床上治疗ALD的药物筛选平台。总之，该研究建立的ALD类器官模型可以作为临床上研究ALD疾病机制，开发治疗药物和个性化医疗的理想平台。
Development of an alcoholic liver disease model for drug evaluation from human induced pluripotent stem cell-derived liver organoids
Zhiwei Feng1, Bingrui Zhou1, Qizhi Shuai1, Yunliang Wei1, Ning Jin1, Xiaoling Wang1, Hong Zhao1, Zhizhen Liu1, Jun Xu2,*, Jianbing Mu3,*, Jun Xie1,*
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Key Laboratory of Birth Defect and Cell Regeneration, MOE Key Laboratory of Coal Environmental Pathogenicity and Prevention, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China, 2Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery and Liver Transplant Center, the First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China, and 3Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12735 Twinbrook Parkway, USA
通讯作者
解军，山西医科大学基础医学院教授，博士研究生导师。现任山西医科大学校长，煤炭环境致病与防治教育部重点实验室主任，出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室主任，教育部基础医学教学指导委员会委员，中国生物化学与分子生物学学会副理事长，山西省生物化学与分子生物学学会理事长，山西省晋课联盟理事长。先后主持国家重点研发计划“新冠疫苗接种的卫生经济学评价和大规模接种的实施性研究”、国家自然科学基金区域联合基金重点项目“叶酸不应答型神经管畸形重要易感因素、发病机制及早期干预研究”课题等10余项。在Biomaterials、Advanced Healthcare Materials、JACC-Basic to Translational Science、Cell Death & Disease、International Journal of Biological Macromolecules等杂志发表论文100余篇，获批发明专利10余项。先后获得第五届“山西省优秀科技工作者”（2009），“山西省教学名师”（2013）、国家级教学成果奖二等奖、山西省科学技术奖一等奖、二等奖等10余项。
THE END
ABBS《生物化学与生物物理学报》，1958年创刊，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）主办，主编丁建平研究员。本刊为完全开放获取（OPEN ACCESS）期刊。出版生物化学、分子生物学、生物物理学的综述、论文和简讯。入选中国科技期刊卓越行动计划梯队期刊类项目。JCR IF为3.3，生物化学与分子生物学领域Q2，生物物理学领域Q1。中科院期刊分区表生物学2区。
审核 徐明华/徐文琳
编辑 寿彩华/郑福军/蔡花漫 美工 寿彩华
编辑部 abbs@sibs.ac.cn
