上海交通大学俞卫锋团队：单细胞生物信息学分析损伤后DRG细胞再生动态转录变化

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周围神经损伤（PNI）可使初级感觉神经元进入可再生状态。然而，初级感觉神经元的神经再生相关转录组变化尚不清楚。本研究对小鼠慢性收缩损伤后第3天神经损伤早期的背根神经节（DRG）细胞进行单细胞RNA测序，观察到CCI诱导了一群高水平表达激活转录因子（Atf3）的神经元群集（CIP）。CIP神经元高表达再生相关基因。此外，细胞间通讯网络表明，CIP神经元与卫星胶质细胞之间有密切的通信信号，并且CIP神经元特异性地向卫星胶质细胞传递强烈的Fgf3-Fgfr1信号，这一信号可能启动卫星胶质细胞中与再生相关的转录变化。对ATF3的免疫荧光染色结果表明其在CCI后3天开始显著增加，在CCI后1个月开始下降，从而证实神经再生发生在神经损伤的早期阶段发生。2024年11月13日，上海交通大学医学院附属仁济医院俞卫锋团队在Acta Biochimica et Biophysica Sinica期刊发表了题为“The peripheral Atf3+ neuronal population is responsible for nerve regeneration at the early stage of nerve injury revealed by single-cell RNA sequencing”的研究论文，在单细胞水平上的生物信息学分析提高了对损伤后DRG细胞再生动态转录变化及其潜在分子机制的理解。

研究人员将对照（CON）小鼠和慢性收缩损伤（CCI）小鼠的左腰4-5 DRG分离的细胞进行了单细胞RNA测序。经质控处理后，共从CCI小鼠和CON小鼠4个样本中获得21,592个细胞。根据基因表达模式将所有细胞划分为7种主要细胞类型，其中包括神经元、卫星胶质细胞、成纤维细胞、周细胞、免疫细胞、雪旺细胞和内皮细胞。根据典型DRG神经元标记物，将两组3723个神经元重新聚类为11个神经元亚群，在CCI组中发现了一群以Atf3为标记基因的新神经元群集CIP（图1）。

图1. DRG细胞根据其标记基因被识别为7种细胞类型

CCI组神经元显著上调了Sprr1a、Atf3、Gap43、Flrt3、Gal、Sox11、Gadd45a、Gpr151和Serpinb1a等再生相关基因。qRT-PCR证实了单细胞测序的结果。GO分析显示，CCI后神经元中上调的差异基因主要富集于再生相关的功能，如神经系统发育、微管细胞骨架的组织和神经元投射结构。此外，下调的差异基因与外周刺激和信号转导等功能显著相关，包括蛋白定位到质膜、离子跨膜运输和突触囊泡的胞外分泌。这些下调的基因包括离子通道基因Kcnb2、Kcnb1、Scn9a、Scn10a、Scn8a和Pacsin1（图2）。

图2. DRG神经元的转录重编程与神经再生相关

分析结果显示CIP神经元以再生相关基因Sprr1a、Atf3、Camk1、Flrt3和Gpr151作为标记基因。研究人员在此展示了CIP神经元的差异基因富集的前20个功能条目，包括神经再生相关功能（神经系统发育、肌动蛋白细胞骨架组织、神经元投射发育、轴突引导、肌动蛋白丝组织、神经元投射形态发生等）、翻译增加和凋亡过程。此外，前20条CIP神经元的差异基因富集的通路主要参与凋亡信号和间隙连接信号。

为了表征CIP神经元的转录组模式，将CIP神经元的差异基因分为四组：细胞因子及其相关受体基因、生长因子及其相关受体基因、G蛋白偶联受体和离子通道相关基因，CIP表现出独特的转录组模式特征。在细胞因子及生长因子模块中，Tnfrsf8、Igfn1、Tgfbi和Igfbp3在CIP中特异性表达；在GPCR模块中，Gpr151和Cckbr在CIP中高度特异性表达。另外，CIP神经元表现出钾通道表达增加（Kcnmb4、Kcnmb4os2和Kcnk16），钠通道的表达减少（Scn9a、Scn10a和Scn11a），与疼痛转导相关的非选择性阳离子通道Trpv1和Trpa1在CIP中的表达也有所下降。这些基因在很大程度上影响神经元的兴奋性，并与疼痛传导有关（图3）。

图3.  一群新型的CCI诱导神经元亚群与神经再生相关

二元调控子活性矩阵显示，Atf3、Bach1、Nfil3、Stat5a、Sox9和Vax2这6个转录因子是CIP的特异性调控子，并观察到这些转录因子共同调控基因Csf1、Tnfrsf12a、Igfbp3、Gpr151和Fgf3。

研究人员分别在第3天、第7天、第14天、第1个月和第2个月对假手术小鼠和CCI小鼠的DRG切片进行ATF3免疫荧光染色。免疫组织化学结果表明，ATF3早在CCI后第3天显著升高，并在CCI后1个月开始逐渐降低。以往研究表明，ATF3表达变化的时间过程与神经远端残肢支持轴突生长的能力一致。这些结果提示，CIP神经元可能在CCI后神经再生中起关键作用（图4）。

运用CellChat推断出的细胞群之间的通信网络。结果显示，CIP与内皮细胞、卫星胶质细胞和成纤维细胞通信密切。尤其是CIP-卫星胶质细胞的相互作用强度明显大于其他神经元亚型，表明CIP与SGCs之间存在较强的联系。

在以往的研究中，卫星胶质细胞在神经损伤后的轴突再生过程中发挥了重要作用。而GFAP是卫星胶质细胞激活的标志。GFAP免疫组化染色显示，CCI后3天小鼠DRG中卫星胶质细胞的激活明显高于假手术组小鼠，并且激活的卫星胶质细胞紧密包裹ATF3+神经元。然而，轴突损伤如何激活DRG中的卫星胶质细胞，进而促进其转录组学变化以支持轴突再生的过程尚不清楚。GO分析表明，CCI后卫星胶质细胞对细胞外生物信息的响应增强。为了确定参与此通信的特定配体或受体，我们检测了当CIP作为信号来源时与其他细胞之间的配体-受体对。结果表明，Fgf3-Fgfr1特异性地从CIP神经元发送，并主要传递到卫星胶质细胞（图5）。

图5. CIP与其他非神经细胞之间的细胞间通信

该研究阐明了周围神经损伤后初级感觉神经元的单细胞转录组变化，鉴定出一群高表达神经再生和修复相关基因的新CIP神经元。CIP神经元可能特异性地通过Fgf3-Fgfr1信号激活卫星胶质细胞的促再生转录。因此，本研究推进了目前对周围神经再生的认识，为神经再生治疗提供潜在靶点。