摘要：
牛巴氏杆菌病也称牛出败，是由多杀性巴氏杆菌引起的急性，热性传染病，是牛呼吸道疾病(BRD)主要细菌性的主要致病源之一[1]。临床上主要表现为三种型（败血症型、水肿型、肺炎型）。发病主要以呼吸系统疾病和出血性败血症为主要特征，其也是引起呼吸道综合征（BRD）的主要细菌病原。该疾病可以在动物间垂直传播，同时也可以传染给人，引发人的脑膜炎和心内膜炎等。
目前，世界各主要养牛地区均有该病的报道，我国亦是该病的主要疫区之一，严重危害我国养牛业的发展[2]。本病多为散发。该致病菌存在于病畜的全身各组织、体液、分泌物及排泄物中，经消化道和呼吸道感染。当寒冷、闷热、潮湿、拥挤、通风不良、疲劳运输、饲料突变、营养缺乏等时，可引起牛发生本病。
肺炎型巴氏杆菌病犊牛与成年牛都可发生，呼吸次数增多，咳嗽，干咳、震颤、鼻孔有脓性分泌物。体温升高到39.3℃以上，采食量降低、步态僵硬、外形瘦弱和偶发腹泻，初始症状大约持续2-3日，然后发展成肺炎，最终导致死亡。
如未发生死亡而转归为慢性，犊牛生长停滞，消瘦，被毛粗乱，不时咳嗽，药物治疗虽有好转，但不久又复发，大多进入恶病质状态，死亡或淘汰率高。败血症型巴氏杆菌病病牛呼吸快，咳嗽有的口角带有血色的泡沫，呼吸发出声音。体温升高到40.0℃以上。死亡率高，常呈散发或地方性流行。
通常兽医没有看到犊牛发病，牛已经死亡或看到发病牛处于濒死状态。水肿型巴氏杆菌病病牛皮肤和粘膜普遍发绀患畜呼吸高度困难，流泪，并出现急性结膜炎。除呈现全身症状外，在颈部、咽喉部及胸前的结缔组织，出现迅速扩展的炎性水肿，初热、痛而硬，后变凉，疼痛减轻同时伴发舌及周围组织的高度肿胀，舌伸出齿外，呈暗红色[3]。
为了解石河子地区牛巴氏杆菌病流行情况，针对奶牛场、肉牛场及散户进行现场调查结合实验室诊断。为牧场防控巴氏杆菌病提高科学的建议
01
材料与方法
2 试验仪器
超净工作台购自上海鸿都电子自科技有限公司；电泳仪购自杭州雷琪实验器材有限公司。
细菌基因组DNA提取试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；2x Taq Plus Master Mix Ⅱ购自诺唯赞生物科技股份有限公司。瑞氏染色液采购自海博生物科技有限公司。
4 现场流行病学调查
对石河子地区规模化牛牧场进行牛巴氏杆菌病的现场调查，濒死犊牛剖检，与各场内管理人员、饲养员及兽医等相关人员，沟通了解奶牛场的存栏头数、分类结构，疑似发生巴氏杆菌病牛头数，发病季节、特点等相关情况；观察牛场位置及周围环境；调查牛群的用药情况等。
5 分子流行病学调查
取肺脏病料培养后涂片自然干燥后进行革兰氏染色法后镜检观察。
根据参考文献[4]中巴氏杆菌特异性基因kmt引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表3。以提取总DNA为模板RCR扩增，进行kmt扩增，PCR的反应条件，见表4。PCR 产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，130V恒压电泳30min，使用凝胶成像系统拍照分析。
02
结果
2.1现场流行病学调查结果
石河子周边地区牛巴氏杆菌病一年四季均有发生，犊牛从0-4月龄不同牧场均有不同程度的发生，发病率根据牧场环境，保健流程，饲养管理有非常大的关系。保健流程完善的牧场犊牛发病率较低，犊牛成活率可达到95%以上。
现场调查发现0-2月龄的犊牛，出现呼吸次数增多，咳嗽，干咳、震颤、鼻孔有脓性分泌物见图1、2。体温升高到39.3℃以上，采食量降低、步态僵硬、外形瘦弱和偶发腹泻，初始症状大约持续2-3日，然后发展成肺炎，最终导致死亡。如未发生死亡而转归为慢性，犊牛生长停滞，消瘦，被毛粗乱，不时咳嗽，药物治疗虽有好转，但不久又复发，大多进入恶病质状态，死亡或淘汰率高，见图3、4。
剖检后可观察到肺脏、心肌（肌肉）黏膜及其他气管广泛性出血斑，肺部水肿，间质性肺炎（纤维环），伴发出血性胃肠炎，在水肿病例中出现头、舌、胸、单肢或者多肢出现广泛性水肿，伴有淤血,见图5、6、7、8。
5个规模牧场均远离城镇，奶牛场每天饲喂三次TMR，自由饮水，且定期消毒和驱虫，免疫及时，均未免疫巴氏杆菌疫苗。哺乳犊牛犊牛岛饲养，冬季寒冷与夏季中气候突变，圈舍密度过大时容易出现牛群散发，严重的牧场会出现群发。
2.2分子流行病学调查
2.2.1肺脏细菌培养镜检
显微镜下可观察肺脏中含有大量球杆状或短杆状的革兰氏阴性菌，呈明显的两极着色。
2.2.2 PCR检测结果
取肺脏组织提取的总DNA使用巴氏杆菌kmt特异性引物进行PCR检测，结果显示本样品为巴氏杆菌阳性，阳性结果见表5。
图 10 巴氏杆菌kmt特异性引物PCR结果
M:DNA Marker；1-4：鼻拭子样品；5-7：肺脏组织；8：阳性对照；9阴性对照；
石河子周边地区奶牛场A、B、C巴氏杆菌鼻拭子抗原阳性率分别为75%(9/12)、75%(3/4)、57.14%(4/7)。奶牛场A、B巴氏杆菌肺脏抗原阳性率分别为100%(2/2)、100%(2/2)。肉牛场A、B巴氏杆菌鼻拭子抗原阳性率分别为80.0%(16/20)、65.0%(13/20)。肉牛场A、B巴氏杆菌肺脏抗原阳性率分别为100%(4/4)、100%(4/4)。石河子周边调查的五个牧场具有呼吸道症状的犊牛巴氏杆菌鼻拭子样品抗原阳性率为71.43%(45/63)。因肺炎濒死的牛只剖检结果表明，巴氏杆菌抗原阳性率为100%(12/12)。
03
讨论
3.1肺炎主要致病菌的病因及临床症状
犊牛肺炎发病原因越来越复杂，因抗生素过度使用，导致细菌耐药性逐年升高，巴氏杆菌现阶段部分地区采用常规抗生素治疗效果不佳，甚至是没有效果。通常还会与溶血性曼氏杆菌、支原体等出现混合感染。牛巴氏杆菌病是发生在牛身上的一种常见病害。病牛体温会明显上升，甚至会超过40 ℃，食欲不振、反刍能力也有所下降，并伴有呼吸困难、伸颈张嘴呼吸的情况，精神萎靡不振。牛巴氏杆菌病特征是败血症和组织器官的出血性炎症[5]。现阶段牧场犊牛肺炎发生病因通常为混合感染存在，表现为两种甚至多种疾病混合感染，而统一的表现为犊牛发病前期体温升高，咳嗽，清水鼻涕。发病中期甚至后期，犊牛精神沉郁、食欲不振甚至废绝，咳嗽，腹式呼吸，流黏脓性鼻液等。剖检后均可观察到不同程度肺脏的病变，病变的形态与感染的主要致病菌有极大的关系。
3.2呼吸道致病菌流行现状
Pardon B等人对比利时部分牛场患呼吸系统疾病的病牛进行调查，巴氏杆菌分离率为26.0%[6]。曼氏杆菌是一种对牛羊等反刍动物危害十分严重的呼吸道传染性疾病。国内研究表明对牛源溶血性曼氏杆菌分离鉴定，其发病率为9%-40%，致死率为25%-50%[7]。2020 年，赵金玉的研究结果表明，新疆南疆规模化牛场犊牛牛支原体阳性率为28.57% (36/126)[8]。
现阶段这三种呼吸道主要致病菌在全国甚至全世界各地均有广泛流行。
3.3呼吸道疾病混合感染的主要防控措施
采用大环内酯类药物（泰拉霉素、加米霉素、阿奇霉素等）和喹诺酮类药物（恩诺沙星、马坡沙星）同时配合解热镇痛抗炎药物使用（美洛昔康、氟尼辛葡甲胺等）针对肺炎呼吸道主要致病菌有较为明显的效果。患有呼吸道疾病犊牛务必在前期提前揭发，进行有效的治疗。
现阶段国内已经有非常成熟的巴氏杆菌疫苗产品，针对有过既往病史的牧场，免疫相应的疫苗。根据牧场牛只不同的发病阶段采取相应的免疫程序。保证牧场牛群整体较高的抗体水平，根据病因调查对牛只进行特异性免疫。
04
小结
石河子周边地区肺炎的牛中巴氏杆菌病发病率较高，应做好疫苗防控，出现发病牛只提前揭发，进行隔离，并使用有效的方案进行治疗。
参考文献
[1]李宗才.奶牛巴氏杆菌病的诊断与治疗[J].中国畜牧兽医, 2010(11):1.
[2]杜梅卓,张才旦卓玛.肉牛出血性败血症诊断与预防[J].畜牧兽医科学：电子版, 2020(2):2.
[3]王久毅.肉牛巴氏杆菌病的流行病学,症状,鉴别和防治措施[J].现代畜牧科技, 2020(4):2.
[4]邬琴, 张星星, 顾晓晓. 牛源多杀性巴氏杆菌血清分型及毒力相关基因的检测研究[J]. 中国 畜牧兽医,2020,47(6): 1910-1920.
[5]翁业斌,李建军,吴建勇,等.新疆犊牛肺炎病原分析和临床防控[J].草食家畜, 2017(4):5
[6]Pardon B,Stuyven E,Stuyvaert S,et al.Sera from dams of calves with bovine neonatal pancytopenia contain alloimmune antibodies directed against calf leukocytes[J].Veterinary Immunology & Immunopathology, 2011, 141(3-4):293-300.
[7]李雪霞,李富祥,赵文华,等.云南羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].上海畜牧 兽医通讯, 2014(01)：36-38.
[8]赵金玉. 新疆南疆部分地区规模化牛场牛支原体分子流行病学调查及分离鉴定[D].塔里木大学， 2021.
END
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