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脓肿分枝杆菌复合群病研究进展
分枝杆菌是一类复杂而多样化的细菌，包括结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌(Nontuberculosis mycobacteria，NTM)[ 1 ]。迄今为止，被发现的NTM菌种超过200种和19个亚种[ 2 ]。随着人口结构的变化、肺部的放射学诊断和分枝杆菌种类鉴定技术的进步，以及结核病的控制和下降，全球范围内NTM感染的检出率和疾病负担显著增加。在中国，NTM的分离率呈逐年上升的趋势，尤其在潮热地带和沿海地带更为常见，且种类更加丰富[ 3 ]。
虽然我国各地NTM的分离率和种类存在差异，但脓肿分枝杆菌复合群(Mycobacterium abcessus complex, MABC)(在NTM中约占22.2%~23.1%)仍是分离率最高的快速生长型分枝杆菌[ 3 , 4 ]。由原来以医源性感染为主转变为感染性疾病，且主要以脓肿分枝杆菌肺病为主[ 5 , 6 , 7 ]。MABC广泛分布于环境中，能够引起多种感染，包括囊性纤维化(Cystic fibrosis，CF)或支气管扩张(Bronchiectasis，BE)患者的肺部感染，皮肤和软组织感染，以及免疫功能低下个体的播散性感染[ 8 ]。该菌最早于1952年由Moore和Frerichs[ 9 ]从膝关节分离出并命名为龟分枝杆菌脓肿亚种。随着药敏试验和基因测序等技术的不断发展，脓肿分枝杆菌在1992年被独立为单独的菌种[ 10 ]。目前，根据rpoB和hsp65基因片段，MABC被分为脓肿分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mab)、脓肿分枝杆菌马赛亚种(Mycobacterium abscessus subsp. massiliense, Mma)和脓肿分枝杆菌博莱亚种(Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, Mbo)3个亚种[ 1 ]。我国以Mab最为常见(占73.8%~75.9%)，其次是Mma(占10.1%~26.2%)，Mbo最为少见(占0~14.7%)[ 11 , 12 , 13 ]。在临床实践中，不同脓肿分枝杆菌亚种感染的肺病患者抗菌药物治疗的效果存在显著差异，其中包括克拉霉素(Clarithromycin, CLA)在内的联合抗菌药物治疗对Mma肺部疾病患者的治疗反应率远高于Mab肺部疾病患者，这与CLA的耐药机制有关[ 7 , 14 ]。本文就MABC的基本特性、耐药机制，以及诊断治疗的研究进展作一阐述，以期加深对该病原体的认识。
1 MABC的基本特性
与其他分枝杆菌一样，MABC广泛存在于自然环境中，如土壤、水源和淋浴喷头等环境，感染来源也多种多样，包括外伤、手术、器械污染及呼吸道感染等。以下从MABC的生物学特性、临床相关性、传播特点和亚种组成分别展开介绍。
1.1 生物学特性
MABC是Runyon IV群(快速生长型)中的一种不产色的需氧芽孢杆菌，革兰染色为阴性，幼龄菌抗酸性强，但陈旧性的菌株则逐渐失去抗酸性[ 15 ]。该菌生长对培养基要求不高，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上表现出良好的生长能力，表面呈粗糙的米黄色。该菌在45 ℃不生长，在28℃时生长，可在麦康凯琼脂及M-H琼脂生长[ 16 ]。MABC菌落具有2种不同的形态特点：光滑型(S型)和粗糙型(R型)。S型的菌落均匀、圆形且有光泽，而R型的菌落是不规则的、干燥的和绳索状的[ 17 ]。这些菌落形态的差异主要取决于菌落中是否存在糖肽脂(Glycopeptidolipids，GPL)。GPL由肽、脂质和碳水化合物组成，是暴露在细菌表面的宿主免疫识别的决定因素[ 18 ]。在感染期间，该菌落还会发生从S到R形态类型的转变[ 18 ]。相比S型菌株，R型菌株缺乏亲水性GPL成分，增加了其疏水性，也证实了GPL产生与亲水性呈正相关[ 19 ]。此外，R型MABC还可形成生物膜样结构，比S型菌株更能耐受酸性pH值、过氧化氢和抗菌剂[ 20 ]。
1.2 传播特点
目前，关于MABC是否会在人群中传播存在争议。Bryant等[ 21 ]利用全基因组测序(Whole-genome sequencing，WGS)技术回顾性分析了CF患者中分枝杆菌感染的传播路径，确定了全球存在多种主导循环克隆(Dominant circulating clones，DCCs)，表明了存在MABC的全球传播网络，并且这种传播很有可能是间接的。DCCs最初是在非CF人群中出现的，但随后通过CF社区进行了扩增和传播[ 22 ]。这些研究引起了人们对交叉感染的担忧。然而，有研究确定了CF患者的基因组聚类，这些患者之间没有流行病学联系，并得出没有交叉传播证据的结论[ 23 ]。最近在英国，一项纳入CF和非CF患者的大规模回顾性研究表明，尽管有少数病例显示可能存在人际传播，但不是英国全国范围内MABC传播的主要机制[ 6 ]。因此，在医疗机构中MABC感染其他患者的风险相对较低。然而，对于我国的MABC，其主要传播途径仍未明确阐明。
1.3 临床相关性
根据我国结核病监测规划报告，我国NTM在临床痰培养的分离率不断提高，由1979的4.3%到2010年的22.9%，NTM病也越发引起临床的重视。但由于NTM疾病的临床表现不典型、影像学上无特异性，以及在收集病原学的资料时遇到的影响因素较多，临床中易出现对本病的误诊或漏诊。NTM是否致病由环境因素和宿主因素等共同决定，其中宿主因素为更为关键的因素[ 24 ]。NTM的环境来源包括土壤、水源和室内加湿器产生的气溶胶。与NTM肺病相关的宿主因素包括免疫力损伤和肺部结构变化，如感染人类免疫缺陷病毒(HIV)[ 25 ]、恶性肿瘤[ 26 ]、使用免疫抑制剂[ 27 ]、BE[ 28 ]、CF[ 28 ]、慢性阻塞性肺病[ 29 ]、尘肺沉着病[ 30 ]及原发性纤毛运动障碍[ 31 ]等。在判断NTM感染患者临床相关性时，应从下面几个方面进行：(1)NTM的种类，对于NTM肺部疾病的实验室诊断，建议进行培养以及菌种鉴定，以增强生长检测并确定分离株的临床相关性[ 32 ]；(2)分离出NTM的部位是否可信，取材部位及取材过程是否容易受到环境污染，有助于提示临床医师该结果是否为污染导致[ 33 ]；(3)患者是否具有危险因素，女性、老年人、肺部结构性改变和糖尿病患者等都是感染NTM肺病的危险因素[ 4 ]，临床医师在诊断时应该考虑到患者是否具有危险因素；(4)患者常住地，我国NTM的流行病学调查发现，全国范围内NTM表现出地理多样性，并且由北向南，由西向东逐渐增加[ 4 ]。不同地域流行的NTM菌种不同，临床医师也须留意[ 34 ]。因此，在诊断NTM病时有必要了解患者的流行病学史，明确其病原学、肺部结构变化和样本采集部位，排除样本污染和细菌定植的可能[ 35 ]。此外，美国胸科协会发布的NTM肺病诊断指南中明确指出，诊断标准只能应用于部分分枝杆菌，如鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等经常致病的非NTM，对于偶发分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌等较少致病的NTM并不适用[ 36 ]。
MABC是致病潜力最高、最有可能引起临床重大疾病且痰涂片阳性的物种，因此值得特别注意[ 25 , 37 ]。它是一种机会致病菌，既能引起真正的感染，也可作为无害的菌群存在于宿主体内[ 38 ]。单一菌株MABC能在人类宿主体内持续存在，并随着时间的推移积累自发突变[ 39 ]。目前，对于分枝杆菌的定植与活动性疾病，尚无统一的区分方法，临床医师通常凭经验判断。但即使患者相对无症状，也可能存在侵袭性疾病。有研究表明，基于多位点序列分型(Multi-locus sequence typing，MLST)的分子流行病学方法可用于区分再感染与持续感染，以及持续定植与再定植[ 38 ]。此外，临床医师还需要关注结核病疗效不佳是否实际是因感染MABC而误诊导致的。
2 MABC的常见耐药机制
MABC生长繁殖迅速，对多种抗菌药物均有耐药性，下面将从MABC的天然耐药性、适应性耐药性和获得性耐药性展开介绍。
2.1 天然耐药机制
天然性耐药是指MABC内在对某些抗菌药物具有较强的抗性。常见的耐药机制包括：(1)细胞壁低渗透性，MABC的细胞壁中含有长链脂肪酸、尿酸和糖脂等化合物，这些化合物可以限制抗菌药物进入细胞，从而导致对抗菌药物的耐药性增加[ 40 ]。此外，MABC细胞壁包含大量脂质，如真菌酸，能对亲水性化合物形成疏水屏障[ 41 ]；(2)活性氧清除，MABC具有高效的抗氧化系统，可以清除氧自由基等活性氧物质，减少药物对细菌的杀灭作用[ 42 ]；(3)药物靶基因突变，MABC天然具有多种基因突变，这些基因突变可以导致药物的靶点发生变化，从而使药物失去作用[ 43 ]。其中embB编码乙胺丁醇靶向的阿拉伯糖基转移酶[ 44 ]，gyrA编码氟喹诺酮靶向的旋转酶[ 45 ]，而KatG抑制一种参与分枝菌酸合成的酶InhA[ 46 ]，使得其对乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物和异烟肼天然耐药；(4)抗生素酶的作用，MABC可表达多种修饰抗生素的酶，从而导致对大多数抗菌药物的耐药性[ 47 ]。如MABC携带的MAB_0591基因，编码催化利福平的ADP核糖转移酶，使该药物失去活性[ 48 ]；MAB_2875编码的β-内酰胺酶blaMab可导致亚胺培南和头孢西丁被缓慢降解从而耐药[ 49 ]；MAB_4395编码一种2′-N-乙酰转移酶[AAC(2′)]，其会乙酰化带有2′氨基的氨基糖苷类药物，如庆大霉素、妥布霉素和卡那霉素[ 50 ]；(5)外排泵上调，MABC可以改变自身的药物代谢途径，使药物无法在细胞内积累，从而减少其对细菌的杀灭作用[ 51 , 52 ]。其中MmpL转运蛋白是一种重要的多药外排泵，通过外周将底物转运到细胞外环境。TetR的转录抑制因子MAB_4384点突变与MmpS5-MmpL5复合物外排泵的表达增加和对硫代乙酮类似物的耐药性有关[ 53 ]。
2.2 适应性耐药机制
当MABC暴露于抗菌药物环境中，可能会出现适应性耐药性，这时菌株未获得新的耐药性突变或遗传元素，而是由于基因或蛋白质表达对外部触发的反应而发生变化[ 1 ]。适应性耐药主要出现在大环内酯类药物和氨基糖苷类药物中，这与erm41基因的表达情况密切相关。erm41是一种编码核糖体的甲基化酶，可以使rrl基因(23S rRNA)的2 058位点核苷酸甲基化，从而诱导大环内酯耐药[ 54 ]。在不同的MABC中，适应性耐药的发生存在显著性差异。其中Mma的erm41基因是短缺的，使得该亚种不会产生此类耐药，而当Mab和Mbo的erm41基因第28位核苷酸由C碱基突变为T碱基，可以使得MABC对大环内酯类抗生素产生诱导性耐药[ 55 ]。此外，MABC对阿米卡星的耐药也是可以被诱导的，导致这一现象的确切机制尚不清楚，但核心16S rRNA甲基化酶可能参与这一过程[ 56 ]。
2.3 获得性耐药机制
MABC的获得性耐药性依赖于编码特定药物靶点的基因修饰，如基因突变或基因水平的转移来获得对抗菌药物的耐药性。长期使用大环内酯类药物和氨基糖苷类药物会使MABC出现获得性耐药。大环内酯类药物出现获得性耐药主要是由于rrl(23S rRNA)基因的突变，如2 058和2 059位的核苷酸变化[ 57 ]。同样，氨基糖苷类药物的获得性耐药是由于rrs(16S rRNA)基因出现突变，其中1 408位点突变可使MABC对卡那霉素、阿米卡星和妥布霉素表现出高水平的耐药性[ 58 ]。因此，临床中使用大环内酯类药物和氨基糖苷类药物时，最好对患者MABC临床分离株的erm41、rrl和rrs基因进行检测。
3 MABC病的诊断
MABC感染的快速和准确诊断对于有效治疗和控制疾病传播至关重要，但MABC病的诊断可能具有挑战性，因为MABC可能被误鉴定为其他分枝杆菌或其他类型的细菌。准确的诊断需要在排除污染的前提下，结合临床、影像学、病原学及病理检查结果，且对于痰液至少2份分开送检的样本培养阳性且鉴定为同一菌种，而无菌样本需要至少1份样本培养阳性并鉴定为NTM才可诊断[ 35 ]。近年来，关于MABC及亚种的快速鉴定及诊断技术研究的不断应用，使患者能够更及时地得到诊治。常规的NTM实验室诊断方法包括涂片显微镜检查、采用固体培养基或液体培养基分离培养、采用对硝基苯甲酸选择性培养基或MPB64抗原检测法区分结核分枝杆菌和NTM，并采用生物芯片法鉴定NTM菌种[ 35 ]。最近的研究集中在开发新的诊断工具：如多重PCR检测[ 59 , 60 ]、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)[ 61 ]和WGS[ 62 ]，这些工具可以快速鉴定MABC亚种并将其与其他NTM区分开来。其中，WGS是指对某个生物个体的全部基因组进行高通量测序的技术，它是遗传匹配的最高分辨率方法，可以对MABC的基因组进行全面、高效、准确的测序和分析，为深入研究该菌种的致病机制、毒力因子及抗菌药物耐药性等提供了有力的手段和数据支持。因此，建议临床医师在面对疑似MABC感染的患者时使用上述方法快速诊断并指导用药，同时检测的结果有助于研究人员开发新的药物和探究耐药位点等。
4 MABC病的治疗
基于美国胸科学会指南以及考虑我国实际情况，MABC常规治疗方案采用口服1种大环内酯类药物，并根据药敏试验结果联合应用氨基糖苷类和β-内酰胺类等药物，以至少3种有效药物进行初始治疗直至痰培养阴转1年以上[ 36 , 63 ]。其中，使用含静脉注射替加环素和阿米卡星>1个月治疗方案的患者治疗成功率显著增加[ 64 ]。然而，由于MABC的耐药机制和药物的不良反应，很多患者难以坚持治疗，MABC治疗效果不容乐观。目前临床建议对MABC进行亚种鉴定，以指导抗菌治疗的选择[ 65 ]。其中，Mab肺病患者痰菌阴转率为25%~42%，复发率为17%~55%，而Mma肺病患者痰菌阴转率高达82%~96%，复发率仅为0~9%[ 7 ]。因此，近年来关于MABC的新型治疗方案不断涌现，为患者提供了更多选择和希望。除了常规的抗菌药物联合疗法，目前还出现了下面几种新型的治疗方案：(1)新型抗菌药物应用，贝达喹啉(Bedaquiline, BDQ)和氯法齐明(Clofazimine, CFZ)是近年来研发的抗结核药物。研究表明，BDQ和CFZ对MABC的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC)均较低，且2种药物的联合使用能够更加有效地抑制该菌的生长和繁殖。此外，这2种药物的使用还能减少耐药菌株的出现，减轻药物对细菌的选择压力，有助于避免细菌的耐药性发展，在部分国家已加入MABC患者的治疗方案中[ 66 , 67 ]；利奈唑胺(Linezolid，LNZ)是一种噁唑烷酮类抗生素，用于治疗革兰阳性球菌引起的感染[ 68 ]。研究发现，LNZ在体外对MABC有着不错的抗菌活性[ 69 ]，且含有LNZ的强化方案可改善MABC的痰培养阴转率，但需要密切监测不良事件[ 70 ]。奥马环素(Omadacycline, OMC)是一种新型氨甲基环素，可以口服使用[ 71 ]。OMC在体外对MABC表现出高水平的抑菌活性[ 72 ]，且OMC可以增加CLA对MABC的活性[ 73 ]。近期已有部分MABC肺病患者应用OMC治疗，耐受性良好且有一定的临床获益[ 74 , 75 , 76 ]；西他沙星(Sitafloxacin, SIT)是一种口服喹诺酮类药物，用于治疗严重难治性感染性疾病[ 77 ]，其对MABC发挥抑菌作用且与临床上重要的抗MABC药物之间无拮抗作用[ 78 ]。在日本，5例由MABC感染引起严重肺炎且合并糖尿病的患者，在门诊接受口服CLA和SIT治疗后获得不错的疗效[ 79 ]。瑞来巴坦是一种新型β-内酰胺酶抑制剂，临床中常与亚胺培南联合使用。有研究通过细胞实验和体外实验证明了瑞来巴坦可提高亚胺培南对MABC的治疗效果[ 80 , 81 ]，这种固定组合可能成为治疗MABC感染的首选β-内酰胺类药物[ 82 ]。同时还有研究探究了阿莫西林-亚胺培南-瑞来巴坦组合治疗MABC的巨大潜力[ 83 ]。此外，还有许多新开发的实验药物在MABC中的抗菌活性等待评估。(2)工程噬菌体疗法，该方法使用溶解性噬菌体来对抗MABC，通过筛选敏感的噬菌体，应用鸡尾酒疗法将3种及以上的抗病毒药物联合使用以减少耐药性，并通过静脉输注。该方法为复发性和播散性的MABC患者提供新的希望，目前已成功应用在部分患者中[ 84 , 85 , 86 ]。值得注意的是，噬菌体需要经过"训练"，即在MABC中反复传代，直到自然选择导致噬菌体适应新宿主。该方法是一种高度患者定制的方法，商业生产不切实际，推广应用存在困难[ 87 ]。(3)其他方法：目前除了上述2种方法外，还有许多治疗方法在开发研究中，包括吸入一氧化氮[ 88 , 89 ]、间充质干细胞治疗[ 43 ]和抗菌肽治疗[ 90 , 91 ]等。
需要注意的是，我国关于MABC药敏试验结果的研究中只有1/3研究的耐药率在25%的变化范围内。因此，针对MABC感染的治疗方案应该根据具体情况而定，患者在接受治疗之前应先进行相应的药敏试验，以确定最佳的治疗方案。
5 结语
近年来，MABC感染是一个重大的公共卫生问题，在中国乃至世界都呈逐步上升的趋势。准确快速的鉴定MABC以及亚种，有助于临床准确做出疾病诊断，并指导用药。MABC的耐药机制非常复杂，其耐药性可能是多种因素共同作用的结果。对MABC的耐药机制进行深入的研究，有助于开发新的抗菌药物来对抗其耐药性。建议临床医师和科研工作者在研究MABC时，可以从多个方面入手，包括：致病性和传播途径、菌株库的建立、抗菌药物的耐药机制和耐药流行特点、快速诊断和新型治疗方法等。
