JES 2024年11月145卷封面文章｜南开大学冯喜增教授团队揭示双酚芴对斑马鱼和小鼠节律活动和肝脏的有害影响

本研究首先在斑马鱼中，发现双酚芴（通过17β-雌二醇/雌激素受体2b（E2/esr2b）信号通路诱导早期肝脏发育异常和昼夜节律紊乱。斑马鱼胚胎急性暴露实验表明双酚芴抑制雌激素受体基因esr2b的表达造成肝脏发育异常增大，并且双酚芴导致的幼鱼节律活动性紊乱表型可以被外源雌激素的加入所挽救，说明幼鱼体内雌激素的平衡在昼夜节律和肝脏疾病的关系中至关重要。接下来在小鼠模型中发现，双酚芴造成雌性小鼠内分泌环境紊乱、节律活动失调、性别偏好行为改变、肝脏相关糖脂代谢能力受损和肝脏病理损伤。然而，双酚芴暴露雌鼠的昼夜节律可通过添加外源褪黑素而恢复，与此同时褪黑素也缓解了双酚芴带来的内分泌环境的紊乱和肝脏相关糖脂代谢及肝损伤。

越来越多的研究发现，时钟基因的紊乱可能会导致机体全身内分泌紊乱，在代谢和肝脏疾病的发病机制中起着至关重要的作用。双酚芴（BHPF）用于制造塑料材料，但其对肝脏稳态的生物学影响尚不清楚。本文通过斑马鱼和小鼠模型，全面研究了BHPF对肝脏疾病、代谢和生物钟的影响及其相关机制，褪黑素（MT）的缓解作用效果也得到了证实。采用不同浓度的BHPF建立急性暴露（0.5和1 μmol/L，受精后1-4天）和慢性口服暴露（0.5和50 mg/kg/bw 2-day)，30天）斑马鱼和小鼠模型。首先在斑马鱼模型中，我们确定了雌激素调节在BHPF干扰的肝脏发育和昼夜运动节律中的关键作用。其次，BHPF暴露小鼠的肝脏和大脑中生物钟因子BMAL1的不平衡表达导致昼夜节律活动混乱；肝脏性别二态性的改变以及生长激素和雌激素的减少在BHPF诱导的糖代谢受损、肝脏炎症和纤维化中起关键作用。此外，外源性MT改善昼夜节律后可减轻BHPF暴露小鼠出现的糖代谢和肝脏损伤。本研究提出了BHPF暴露引起的代谢和肝脏疾病的发病机制，希望能为与内分泌干扰化合物相关的肝脏代谢疾病的治疗提供借鉴。另外，本研究结果可能对日常生活和各种工业应用中的内分泌干扰化合物的管理起到警示作用。

在塑料生产中，双酚芴（BHPF）作为双酚A（BPA）的替代品而引起人们的关注，并有报道证实其在小鼠中发挥抗雌激素作用。在随后的几年中，越来越多的证据表明，在鱼类、小鼠以及猪等动物的研究中，从水体和环境中接触BHPF存在潜在健康风险，包括细胞毒性、发育毒性、炎症反应、脂质代谢紊乱、神经行为干扰、心脏毒性和内分泌紊乱。昼夜节律是一种大约24小时的内源性计时系统，几乎所有重要的生理事件，如营养吸收、储存和代谢，都受昼夜节律的控制。先前的研究表明，昼夜节律紊乱与人类各种肝脏疾病，包括肝脏脂肪变性、炎症或胰岛素抵抗有关。褪黑素（MT）是一种高度保守的分子激素，主要在脑中松果体合成，与昼夜节律的调节有关。过去几十年来，褪黑素在改善睡眠、抗氧化、抗炎、抗凋亡、糖代谢、肝脏和生殖等方面发挥了作用。在先前报道的研究中，褪黑素的加入减轻了BHPF对斑马鱼发育和睡眠/觉醒活动的不利影响。在此基础上，本实验目的是在小鼠中进一步验证BHPF与肝脏疾病和代谢紊乱的关系，并探讨外源性MT恢复昼夜节律后是否可以减轻BHPF带来的代谢损伤。这些结果对了解BHPF造成小鼠肝脏基因性别差异表达与肝脏疾病和生物钟的关系具有重要意义。

考虑到BHPF的抗雌激素作用，在2-96 dpf期间，将斑马鱼幼鱼单独或联合E2（1 μmol/L）暴露于BHPF（0.5或1 μmol/L）中，观察了暴露后的肝脏表型。在72 hpf时，通过转基因斑马鱼品系可观察到表达红色荧光的肝脏图像并对肝脏面积进行定量。结果显示，BHPF处理可增加fabp10a的表达面积。肝成纤维细胞标志物prox1和hhex的表达显著升高也证实了这一现象。与对照组相比，外源性E2暴露导致肝脏面积减小。而与E2共暴露在BHPF中的肝脏面积有所恢复，特别是在BHPF 1 μmol/L中。雌激素受体2b（esr2b）的mRNA相对表达量显示，BHPF暴露显著抑制esr2b的表达，而E2可诱导esr2b表达量上升，因此造成经E2和BHPF共暴露后esr2b表达量有所恢复。这些结果表明，BHPF可能通过E2/esr2b信号调控早期肝脏发育。

图1: 双酚芴（BHPF）或/和17β-雌二醇（E2）暴露后斑马鱼幼鱼肝脏的发育。（a）BHPF或/和E2暴露后，在72 hpf时Tg（fabp10a: RFP）品系幼鱼肝脏的代表性图片。（b）在72 hpf时Tg（fabp10a: RFP）品系幼鱼肝脏荧光面积的量化统计。（c）斑马鱼幼鱼中肝细胞标志物prox1的相对mRNA表达量。（d）斑马鱼幼鱼中肝细胞标志物hhex的相对mRNA表达量。（e）斑马鱼幼鱼中雌激素受体2b（esr2b）的相对mRNA表达量。数据表示为平均值±标准差。n=35-40。N=4。统计学显著性表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

本部分研究了BHPF或E2暴露后幼鱼的昼夜节律变化。睡眠/觉醒行为实验结果表明，与对照组相比，BHPF 0.5和1 μmol/L暴露均可造成幼鱼在白天的活动性异常。BHPF暴露后，幼鱼过于活跃，表现为总休息时间缩短和活动性增加，尤其是在1 μmol/L，它会导致夜间休息回合长度的缩短和休息次数的增加，导致失眠样行为。外源E2（1 μmol/L）的加入可以恢复1 μmol/L BHPF暴露后的昼夜运动，提示雌激素E2可拮抗BHPF引起的昼夜节律异常。昼夜节律受到与外部时间信号同步的内源性生物钟控制，这与生物钟因子有关，如BMAL1、ClOCK。褪黑素（MT）在斑马鱼松果体中表达，并且有促进睡眠的作用，因为它在夜间受生物钟的调节，可能是昼夜节律的调节因子，AANAT2是其合成过程的关键酶。用qRT-PCR法检测了14 h：10 h光/暗周期下重要时钟基因bmal1b、clock1a和aanat2转录水平的昼夜节律变化。结果发现BHPF 1 μmol/L诱导bmal1b的表达在ZT4时显著下降，而clock1a的表达则均被BHPF 0.5和1 μmol/L诱导后显著增加。Aanat2在夜间（ZT16）和白天（ZT4）的表达符合其昼夜振荡表达规律，BHPF 0.5和1 μmol/L在睡眠周期开始（ZT16）时都显著增加了aanat2的表达量。外源E2对斑马鱼的昼夜节律有一定的影响，如活性增加、时钟基因表达异常。而添加外源性E2后可拮抗BHPF 1 μmol/L引起的aanat2表达量增加，使MT合成关键基因的表达趋于正常，与行为表现一致。因此，在幼鱼中，BHPF可能主要破坏时钟基因bmal1和clock1的节律性振荡表达，导致MT合成紊乱。外源性雌激素可拮抗BHPF干扰的时钟基因振荡，维持了正常的昼夜节律运动。

图2: BHPF或/和E2暴露后斑马鱼幼鱼的昼夜节律活动和核心时钟基因表达。（a）实验流程图。（b）BHPF暴露浓度（1 μmol/L）或/和E2（1 μmol/L）暴露下在光/暗（14 h：10 h）周期下幼鱼随时间变化的活动和休息序列。参数计算以每10 min为间隔，平均、归一化后得到。（c）对昼夜活动中的总休息量行为参数进行定量分析。（d）不同处理组下总休息量、休息次数、休息回合长度、总活动量和清醒活动量等5个行为参数的指纹图谱。每一行代表不同的处理组，每一列代表行为参数。黑色条形表示夜间，白色条形表示白天。（e-g）BHPF（1 μmol/L）和/或E2（1 μmol/L）暴露下幼鱼核心时钟基因bmal1b、clock1a和aanat2的mRNA相对表达量的昼夜节律变化。数据表示为平均值±标准差。n=35-40。N=4。统计学显著性表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

首先检测了BHPF暴露对小鼠昼夜节律的影响。自主轮跑实验结果显示，BHPF暴露后，从跑轮活动图上可以看出，小鼠夜间活动多于对照组，高剂量组B50（BHPF 50 mg/kg/bw 2-day）更明显。BHPF暴露对节律周期无显著影响，但影响振幅，从卡方图及统计图可以看到BHPF暴露造成昼夜节律振幅显著增加。对每日活动量化统计后结果表明，BHPF暴露，尤其是B50组，显著增加了小鼠总轮跑活动，减少了总休息次数。上述结果暗示了BHPF造成小鼠昼夜节律的紊乱。褪黑素（MT）作为一种促进睡眠的激素，高剂量B50暴露的小鼠经其补充后（B50+MT），跑轮活动恢复到与对照组类似，而从振幅、总跑轮活动和总休息次数的统计图来看，B50+MT组的振幅与对照组无显著性差异，且显著降低了BHPF导致的活动增加，增加了休息次数，说明MT干预可以挽救BHPF造成的节律紊乱。为了进一步验证BHPF引起的小鼠节律紊乱，检测了小鼠大脑SCN区和肝脏中的生物钟调节因子BMAL1的mRNA和蛋白表达水平。与对照组相比，B50组小鼠SCN组织中BMAL1的mRNA和蛋白水平显著降低，但是MT干预后并没有挽救脑中BHPF导致的BMAL1的缺失。然而，BMAL1在肝脏中的表达趋势与脑中SCN的变化趋势相反，BHPF会造成BMAL1在mRNA和蛋白水平的显著增加，且经MT干预后，BHPF造成的肝脏BMAL1的表达显著下降。因此，上述结果提示BHPF可能通过BMAL1在小鼠大脑和肝脏中的不平衡表达而引起昼夜节律紊乱。

图3: 双酚芴（BHPF）暴露及褪黑素（MT）补充后小鼠自发轮跑实验的行为分析结果和生物钟调节因子BMAL1的表达。（a）小鼠实验装置示意图。（b）在12 h的光照/暗周期下，跑轮运动的行为图。振幅用卡方周期图表示。（c）小鼠自发轮跑实验行为的平均节律振幅。（d）小鼠自发轮跑实验行为的平均周期。（e）总跑轮活动。（f）总休息次数。n=5-6。（g）小鼠大脑SCN组织中BMAL1的mRNA和蛋白相对表达量。（h）小鼠肝脏组织中BMAL1的mRNA和蛋白相对表达量。n=3。N=4。数据表示为均值±标准差。显著性标记为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

为了验证BHPF暴露是否导致除了昼夜节律外的其他行为变化，进行了不同性别间的社会互动测试。在这个测试中，性别选择是基于社交生活中对一个有吸引力的伴侣的偏好，在测试的三箱实验装置中，一只WT雄鼠面对另外2只雌鼠时表现出选择偏好行为，在两侧室中放的是WT雌鼠或实验组雌鼠（Con/B0.5/B50/B50+MT）。运动路径图和热图显示出在特定区域所花费时间的多少，表示每个对象的偏好。当WT雄鼠面对WT雌鼠和Con雌鼠时，它与两侧的互动均匀，与两个对象的互动时间和次数没有显著性差异，说明两侧雌鼠对雄鼠的吸引力是类似的。当WT雄鼠面对WT雌鼠和B0.5组（BHPF 0.5 mg/kg/bw 2-day）雌鼠时，雄鼠也没有明显的偏好。但是结果发现B50组雌鼠降低了其对WT雄鼠的吸引力，表现为雄鼠与WT雌鼠的互动时间和互动次数显著高于雄鼠与B50组雌鼠的互动。另外雄性偏好指数（雄鼠-WT雌鼠互动时间与雄鼠-实验组雌鼠互动时间的比值）显示，雄性小鼠对WT雌鼠的偏好明显高于B50组雌性小鼠，但B50组雌性小鼠经MT补充后，雄鼠面对其（B50+MT组雌鼠）和WT雌鼠时，没有明显的偏好性，表现为互动时间和互动次数没有显著性差异，B50+MT组的雄性偏好指数与单独B50组相比也显著下降。基于以上行为学实验结果推测BHPF影响了小鼠体内性激素水平，改变内分泌环境，导致性别偏好的出现。而MT补充则恢复了昼夜节律，从而稳定了内分泌环境的平衡，恢复了雌鼠对异性的吸引偏好行为。

图4：小鼠经BHPF暴露及MT添加后的性别偏好行为分析结果。（a）性别偏好实验三箱装置实验原理图。（b）受试雄鼠和雌鼠在10 min内的运动轨迹。（c）受试雄鼠和雌鼠在10 min内的路径热图。（d）性别选择测试中雄鼠在两侧雌鼠附近花费的时间。（e）性别选择测试中雄鼠在各室间穿梭的次数。（f）雄鼠在WT雌鼠附近花费时间与雄鼠在实验组雌鼠附近花费时间的比值表示雄性偏好指数。n=10。数据表示为平均值±标准差。显著性标记为*p<0.05和**p<0.01。

上述实验中肝脏BMAL1表达的异常增加提示注意肝脏疾病，再加上昼夜节律紊乱与肝脏疾病的联系，重点关注与肝脏疾病相关的代谢紊乱，因此评估了BHPF暴露4周后的肝脏毒性和MT的干预效果（。在实验期间各组间无死亡记录，实验结果显示小鼠体重随着时间的延长而增加，但是BHPF暴露使小鼠在每一测量时间点的体重低于对照组，尤其是高剂量B50组，在四个时间点均有显著性差异；对照组与B50+MT组无明显差异。各组小鼠在禁食6 h后，检测到BHPF组小鼠空腹血糖水平显著升高，尤其是B50组；而B50+MT组血糖水平与对照组无显著性差异，且与单独B50组相比血糖值显著降低，与对照组无差异。葡萄糖耐量实验（IPGTT）结果显示，15 min时，B50组小鼠血糖值显著高于对照组，也显著高于B0.5组，而经MT补充组的血糖值则显著低于B50组，与对照组无差异。糖耐量曲线下面积（AUC）测定结果表明，B50组小鼠的AUC明显高于对照组，说明其糖耐量遭到了破坏，而B50+MT组则相较于单独B50组来说AUC显著下降，说明MT干预恢复了BHPF损伤的糖耐量。肝脏组织病理学染色结果显示，BHPF暴露后，肝组织中出现肝细胞肿胀和胞质空泡化等变化，尤其是高剂量B50组更为明显；B50+MT暴露组则无明显病理改变。与对照组比较，B50组小鼠肝脏脏器系数显著增加，提示肝脏可能是BHPF的靶器官，而B50+MT组的肝脏系数则显著低于B50组，与对照组无差异。同时，B50组小鼠的ALT和AST水平明显升高，但是B50+MT组的ALT水平有所下降，但是不显著，且增加了AST水平，推测这可能是因为外源物质进入小鼠体内后肝脏器官的应激反应造成的。此外，B50组小鼠的TG水平升高，而MT添加可显著降低BHPF诱导的血浆TG水平。BHPF造成的脂质积聚增加可能是肝脏炎症和纤维化加重的原因之一。BHPF在低浓度0.5 mg/kg bw/2-day时主要诱导炎症基因tnfα的mRNA的增加，而在高浓度50 mg/kg bw/2-day时则诱导炎症相关基因tnfα、il1β和il6的表达水平增加；同时，B50组小鼠也显示出纤维化标志物基因的表达显著上升。经MT补充后，与炎症和纤维化相关的标志基因在B50+MT组的mRNA表达均显著低于B50组。以上结果提示MT能减轻BHPF诱导的小鼠肝脏疾病。

图5：MT对BHPF所致小鼠糖代谢损伤和肝损伤的保护作用。（a）实验流程示意图。（b）各组小鼠实验期间的体重变化。（c）小鼠禁食6 h（上午10：00~下午4：00）后血糖水平。n=10。（d）禁食6 h后的小鼠葡萄糖耐量试验（IPGTT）。（e）糖耐量实验曲线下面积（AUC）。n=5。（f）肝脏组织石蜡切片经H&E染色后各组的代表性图像。（g）小鼠肝脏器官系数（n=10）。（h，i）ELISA试剂盒检测血浆丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。（j）ELISA试剂盒检测血浆甘油三酯（TG）水平。（k）炎症因子标志基因的mRNA相对表达水平。（l）纤维化标志基因的mRNA相对表达水平。n=3。N=4。数据表示为均值±标准差。显著性标记为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

有研究报道了生长激素GH信号通路和性激素通路在建立肝脏性二态性中的关键作用，从而对肝脏生理产生重要影响。根据本实验在昼夜节律、性别偏好和肝脏相关代谢能力等方面的研究结果，重点关注BHPF引起的肝脏性二态的变化，即Cux2，雌性肝脏中雄性特异性基因表达的关键抑制因子，探究其表达及相关通路的变化。首先，与对照组相比，BHPF在高浓度50 mg/kg bw/2-day时造成小鼠GH水平显著降低，而B50+MT组的GH水平表现出明显的恢复。同时，B50组的血浆中E2水平明显降低，经MT添加后有恢复但不显著。而睾酮的水平经BHPF暴露后呈下降趋势，但不具显著性差异性变化。两种特定于性别表达的转录调节因子Tox和Trim24被确认为是Cux2靶点，并可能介导Cux2对雌性偏向基因的间接激活作用。实时荧光定量PCR结果表明，BHPF对Tox和Trim24的转录也有明显的抑制作用，尤其是B50组，但经MT添加后（B50+MT）其mRNA水平较B50组显著上升。雌激素受体ESR1的性别特异性活性在转录水平上受到抑制。相反，B50组造成雄激素受体AR的mRNA水平的升高似乎反映了肝脏性别二态性的抑制。这些结果进一步由骨骼肌纤维组成和组织学的变化而证实。B50组与对照组相比，Ⅲ型糖酵解纤维（Myh1）和慢纤维标记物（Tnni1和Tnnt1）的mRNA表达显著下降，其肌肉显微照片显示网状纤维有中度分离；相应的，B0.5组中Myh1和Tnni1的相对表达水平也下降，但对肌肉组织的影响也较小；B50+MT组则表现出正常的纤维标记物的表达和肌肉纤维表型。以上实验结果证实了BHPF对肝脏基因表达的雌性化有影响。研究发现Bcl6通过选择性地抑制某些倾向于雄性表达的基因，在肝脏性二态性中发挥作用。实时荧光定量PCR实验证实了基因Bcl6在小鼠肝脏中的表达变化，与对照组相比，BHPF在高浓度50 mg/kg bw/2-day时造成Bcl6的mRNA表达明显增加，而B50+MT组则恢复了Bcl6的表达水平。这进一步支持了观察到的Cux2的转录和蛋白水平的表达。BHPF暴露后Cux2的mRNA水平明显降低，但MT添加后能提高B50组的mRNA水平。在BHPF暴露后Cux2蛋白表达水平上也有类似的结果。再结合肝脏组织免疫荧光染色结果，发现B50组Cux2蛋白荧光下降，MT添加后的蛋白荧光水平有所恢复。总之，BHPF抑制了雌性小鼠肝脏中雌性偏向基因的表达，并将肝脏中基因表达模式向雄性化转移，这种改变可能是实验中观察到的肝脏疾病的原因。此外，MT对BHPF诱导的肝脏性二态性改变具有保护作用。

图6: 双酚芴（BHPF）或/和17β-雌二醇（E2）暴露后斑马鱼幼鱼肝脏的发育。（a）BHPF或/和E2暴露后，在72 hpf时Tg（fabp10a: RFP）品系幼鱼肝脏的代表性图片。（b）在72 hpf时Tg（fabp10a: RFP）品系幼鱼肝脏荧光面积的量化统计。（c）斑马鱼幼鱼中肝细胞标志物prox1的相对mRNA表达量。（d）斑马鱼幼鱼中肝细胞标志物hhex的相对mRNA表达量。（e）斑马鱼幼鱼中雌激素受体2b（esr2b）的相对mRNA表达量。数据表示为平均值±标准差。n=35-40。N=4。统计学显著性表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

近年来，生物钟紊乱与肝脏疾病关系的分子机制越来越受到重视。BHPF作为一种常见的内分泌干扰物，其对肝脏损伤和昼夜节律的影响及其机制值得关注。据了解，由于BHPF是从塑料产品中释放出来的，在水环境中的浓度正在逐渐积累增加，这就促使本研究对BHPF的生物学效应进行全面的了解。实验结果表明，BHPF在0.5 mg/kg bw/2-day时对小鼠的昼夜节律和肝功能影响较小。BHPF在高浓度50 mg/kg bw/2-day下扰乱了肝脏和大脑中BMAL1的平衡表达，导致昼夜节律紊乱，内分泌激素和肝脏性别二态性改变。此外，还证明褪黑素对BHPF引起的肝损伤和昼夜节律紊乱有保护作用，与调节体内内分泌系统稳定有关。

张淑慧，女，山东潍坊人，南开大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业博士研究生。现已毕业，2024年7月工作于山东第二医科大学基础医学院。主要从事斑马鱼行为学研究以及内分泌干扰物毒理研究。已在Environmental Research, Chemosphere, Ecotoxicology and Environmental Safety和Life Sciences等期刊发表论文15余篇。

冯喜增，男，天津人，博士、教授、博士研究生导师，1990年至1996年在南开大学化学系，获理学硕士和理学博士学位；1996年至2003年分别在中国科学院化学研究所、美国、英国从事博士后研究；2003年回国，被聘为南开大学特聘教授。主要的研究方向包括鼠卵母细胞成熟的影响机制、帕金森药物对帕金森模型鼠的治疗及其机制、斑马鱼神经生物学方向，并在新型纳米材料、前体药物筛选与分析、内分泌干扰物等生物相容性研究方面取得显著进展，相关研究成果发表在Angewandte chemie-international edition, RSC Advances, Small, Acta Biomaterialia, Journal of Pineal Reasearch，Journal of Agricultural and Food Chemistry，Science of The Total Environment, Environmental Pollution, Aquatic Toxicology，Chemosphere和Environmental Research等期刊上。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1001074223004151

Shuhui Zhang, Xiang Zuo, Jialu Luan, Huijuan Bai, Zhenhua Fu, Mingzhu Sun, Xin Zhao, Xizeng Feng, 2024. The deleterious effects and potential therapeutic strategy of fluorene-9-bisphenol on circadian activity and liver diseases in zebrafish and mice. J. Environ. Sci. 145, 13-27.