Circulation 南京医科大学陈宏山课题组揭示线粒体DNA修饰介导动脉粥样硬化表观遗传新机制

学术   2024-12-17 21:50   山东  
线粒体功能障碍是动脉粥样硬化(AS)发生的关键因素,可导致能量缺乏、氧化应激、炎症小体激活等。然而,在AS过程中线粒体功能障碍的具体分子机制尚不清楚。因此,探索线粒体功能障碍的机制可能为治疗AS提供新的策略和干预靶点。

RNA腺嘌呤6号位氮原子甲基化是迄今为止最普遍最丰富的RNA甲基化修饰,广泛参与生理病理过程。随着定量化学技术的不断发展,近年来人们发现DNA亦存在腺嘌呤6号位氮原子甲基化修饰,且在哺乳动物中线粒体DNA (mtDNA)上大量富集此类表观修饰。但是,mtDNA腺嘌呤6号位氮原子甲基化修饰是否参与生理病理过程研究很少,尤其如何参与AS进程尚无报道。

20241217日,南京医科大学药学院陈宏山课题组在Circulation发表题为METTL4-mediated mitochondrial DNA N6-methyldeoxyadenosine promoting macrophage inflammation and atherosclerosis的研究论文,揭示了甲基转移酶样蛋白4 (METTL4)介导巨噬细胞线粒体DNA发生腺嘌呤6号位甲基化修饰,损伤巨噬细胞线粒体功能并激活炎症小体,促进AS的发生发展。此外,该研究首次筛选到METTL4特异性抑制剂培美曲塞(PEM),并工程化M2巨噬细胞膜包裹蛋白降解靶向嵌合体PROTAC-PEM,实现合成靶向降解巨噬细胞METTL4PROTAC-PEM复合物,进而首次应用于疾病研究,提高AS治疗效率。该研究揭示了线粒体DNA通过腺嘌呤6号位甲基化表观遗传新机制介导线粒体能量代谢重编程调控巨噬细胞炎症水平,为临床治疗延缓AS提供了新思路。

该研究通讯作者为南京医科大学药学院陈宏山教授,共同通讯作者为南京医科大学药学院李雪松副教授和英国曼彻斯特大学王欣教授。第一及共同第一作者分别为南京医科大学药学院江苏省心脑血管药物重点实验室郑龙彬博士生、陈祥博士生及何贤硕士生。该项研究获得国家自然科学基面上项目资助。

本研究创新点主要包括:
1. 首次证实巨噬细胞线粒体DNA (mtDNA)腺嘌呤6号位甲基化通过调控线粒体能量代谢重编程影响动脉粥样硬化发生发展。

2. 首次通过亚线粒体定位检测证实异常METTL4诱发线粒体膜间隙质子积累影响线粒体呼吸链功能,从而干预线粒体膜氧化应激稳态。

3. 首次将线粒体移植技术应用于线粒体核酸系统表观遗传调控研究并揭示其治疗潜能。

4. 首次鉴定出METTL4甲基转移酶活性抑制剂培美曲塞(PEM),填补mtDNA 6号位甲基化领域研究中核心功能酶METTL4缺乏相应抑制剂这一空白,并证实其可有效抑制mtDNA-腺嘌呤6号位甲基化和AS进展。

5. 创新性二元整合蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)技术与巨噬细胞靶向技术,工程化M2巨噬细胞膜包裹PROTAC-PEM,实现合成靶向降解巨噬细胞METTL4PROTAC-PEM复合物,并首次应用于疾病研究,提高AS治疗效率。

详细研究结果报道如下:
为了明确mtDNA腺嘌呤6号位甲基化是否参与AS,研究者通过培养HMDMs (Human Monocyte-Derived Macrophages)HASMCs (Human Aortic Smooth Muscle Cells)HAECs (Human aortic endothelial cells)并给予脂质刺激构建体外AS细胞模型,明确此类修饰主要富集在AS巨噬细胞中。甲基转移酶样蛋白4 (METTL4)是目前唯一已知参与调控此类修饰的甲基转移酶,干扰METTL4基因表达可以有效降低巨噬细胞内此类修饰。通过临床样本、小鼠血管组织和体外实验发现,METTL4AS斑块巨噬细胞中高表达,且与疾病严重程度呈正相关。通过以上结果,研究者首次证实METTL4介导的mtDNA腺嘌呤6号位甲基化富集于AS斑块巨噬细胞中,并与AS进程密切相关。
1. 甲基转移酶样蛋白4 (METTL4)介导mtDNA腺嘌呤6号位甲基化参与动脉粥样硬化进展
为了功能性验证METTL4介导的mtDNA腺嘌呤6号位甲基化在AS中的作用,研究者构建了巨噬细胞特异性METTL4敲除的Apoe-/-小鼠,并给予高脂喂养建立动脉粥样硬化小鼠模型。结果显示,巨噬细胞特异性敲除METTL4可显著降低主动脉根部脂质积累、斑块面积和坏死核心,增加胶原含量,降低腹腔巨噬细胞内此类修饰水平。此外,研究者通过骨髓移植实验进一步证实,巨噬细胞特异性敲除METTL4可有效抑制AS

2. 巨噬细胞特异性敲除METTL4可抑制AS进展

为了探索METTL4介导mtDNA腺嘌呤6号位甲基化促进AS的具体机制,研究者通过RNA-seq测序发现在巨噬细胞中,METTL4介导脂质刺激触发炎症反应。鉴于METTL4主要定位于线粒体且是目前已知唯一可以修饰mtDNA腺嘌呤6号位甲基化的催化酶,因此通过线粒体膜电位、Seahorse、透射电镜等进一步检测线粒体稳态,发现METTL4密切参与脂质刺激导致的线粒体功能损伤进而开放线粒体通透性转换孔道(mPTP),释放mtDNA进入胞浆,激活炎症小体。通过体内实验证实,巨噬细胞特异性敲除METTL4可显著缓解Apoe-/-小鼠腹腔巨噬细胞线粒体功能损伤,同时降低斑块内巨噬细胞炎症水平。以上结果表明,METTL4通过mPTP释放mtDNA进入细胞质促进巨噬细胞炎性小体活化,从而促进动脉粥样硬化的发生。

3. METTL4通过mPTP释放mtDNA激活巨噬细胞炎症小体

为了进一步明确METTL4甲基转移酶活性在其介导巨噬细胞mtDNA腺嘌呤6号位甲基化中的作用,研究者构建了METTL4酶活位点突变质粒并用于细胞转染。结果显示,METTL4酶活位点突变可显著抑制脂质诱导的胞浆中mtDNA的释放、线粒体功能损伤、炎症小体激活和炎症因子的表达。为了阐明mtDNA释放调控炎症的具体机制,研究者通过使用mtDNA抑制剂Etbr和线粒体移植技术证实mtDNA胞质释放参与调控巨噬细胞炎症依赖于METTL4甲基转移酶活性。以上结果表明,脂质刺激导致巨噬细胞中METTL4过表达,促进mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰,损伤线粒体功能,导致细胞质mtDNA释放和炎性小体激活,而这一现象主要归因于METTL4的酶活功能。

4. 在脂质刺激的巨噬细胞中,mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰是METTL4促进线粒体功能损伤的重要因素

mtDNA负责编码线粒体呼吸链复合物的13种亚基。研究者发现,METTL4缺失显著增加线粒体呼吸链复合物V的活性并显著增加其组分MT-ATP6的表达。实验发现,METTL4促进MT-ATP6基因发生mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰,从而降低转录因子TFAMMT-ATP6基因的结合水平,减少其基因表达,进而影响线粒体功能。

ATP6是线粒体呼吸链复合体V的核心成分,通过利用质子梯度产生ATP,而ATP酶活性降低可减缓易位质子的回流,从而导致ROS升高。为探讨METTL4调控线粒体功能的具体机制,研究者首先检测了质子的亚线粒体定位。实验结果发现,过表达METTL4可缓解脂质刺激引起的线粒体膜间隙质子积累,而补充ATP6可逆转这一现象。以上结果表明,METTL4介导巨噬细胞线粒体膜间隙中过量质子的积累,通过调控mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰抑制MT-ATP6表达,从而引发ROS升高和炎性小体活化。

5. METTL4介导MT-ATP6 DNA腺嘌呤6号位甲基化修饰引起脂质积累在线粒体膜间隙

为了功能性验证METTL4甲基转移酶活性在AS中的作用,研究者构建了巨噬细胞特异性METTL4甲基转移酶活性位点突变Apoe-/-小鼠,并给予高脂喂养建立动脉粥样硬化小鼠模型。实验结果表明,此点突变可显著改善线粒体功能损伤,抑制炎症水平,并降低主动脉根部的脂质积累、斑块面积和坏死核心,增加胶原含量。为进一步明确其机制,研究者通过骨髓移植证实,在恢复METTL4甲基转移酶活性后,小鼠模型巨噬细胞中MT-ATP6 DNA腺嘌呤6号位甲基化修饰增加,MT-ATP6表达和线粒体呼吸链复合物V活性降低,线粒体ROS升高,线粒体功能损伤,炎症水平升高,主动脉根部的脂质增加、斑块面积和坏死核心增加,胶原含量降低。以上结果表明,在动物中METTL4亦可通过增加巨噬细胞中MT-ATP6 DNA腺嘌呤6号位甲基化修饰,损害线粒体功能和激活炎性小体,从而加剧动脉粥样硬化。

6. 髓系特异性突变METTL4甲基转移酶活位点可显著降低AS

目前,还没有研究针对METTL4甲基转移酶活性的抑制剂。为了研究靶向METTL4酶活性作为治疗AS的潜在方案,研究者进行多种药物化合物的高通量筛选。METTL4MT-A70家族真核甲基转移酶的同源成员,与METTL3相同,具有保守的MTase结构域,包括DPPW基序。研究者根据拟南芥METTL4MT-A70结构域晶体结构和人源METTL3序列进行同源建模和分子对接,在TargetMol模型中筛选出的18种化合物并发现烟酸占替诺(XN)、培美曲塞(PEM)和利格列汀(Linagliptin)可以有效抑制METTL4的甲基转移酶活性。通过进一步实验证实PEM是最适抑制剂,可有效减少脂质刺激引起的巨噬细胞内MT-ATP6 DNA腺嘌呤6号位甲基化修饰,增加了MT-ATP6表达,降低了线粒体ROS、细胞质mtDNA释放和炎症因子的表达。为验证PEM动物体内治疗效果,通过给予AS小鼠模型8周不同剂量PEM治疗,结果表明,1 mg/kg/3天剂量的PEM显著减少了主动脉动脉粥样硬化病变和主动脉根部脂质积累,减少主动脉根部斑块的病变面积和坏死核心,增加胶原含量和纤维帽厚度。为了进一步阐明PEM治疗AS的具体机制,通过提取腹腔巨噬细胞发现,与对照组相比,PEM可有效降低小鼠巨噬细胞mtDNA腺嘌呤6号位甲基化修饰,增加MT-ATP6表达,降低细胞质中mtDNA的含量,改善线粒体功能,降低炎症水平。以上结果首次证实PEMMETTL4活性抑制剂,可以通过降低巨噬细胞mtDNA 腺嘌呤6号位甲基化减轻线粒体功能损伤和炎症,可能是治疗AS的新型有效化合物。

7. 培美曲塞(PEM)作为首个METTL4拮抗剂能够有效延缓AS进展

蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)是一种新兴的治疗技术,通过泛素-蛋白酶体系统选择性诱导靶向蛋白质降解,其特点是高选择性、低副作用和低耐药性。基于结构化学,METTL4被预测为适合PROTAC介导的蛋白质降解的潜在药物靶点。研究者首先设计了METTL4降解物(dMETTL4,一种选择性降解METTL4PROTAC-PEM试剂),并将dMETTL4装载PLGA纳米颗粒,包被M2巨噬细胞膜,提高PROTAC-PEMAS斑块中M1巨噬细胞的生物利用度和特异性。体内外研究中发现,工程化M2巨噬细胞膜包裹PROTAC-PEM可特异性降解巨噬细胞中的METTL4,有效降低MT-ATP6 DNA腺嘌呤6号位甲基化修饰,增加MT-ATP6表达,改善线粒体代谢功能障碍,减少脂质引起的mtDNA释放和炎症水平,从而缩小斑块面积。以上结果表明,研究者首次证实工程化M2巨噬细胞膜包裹PROTAC-PEM可以通过靶向巨噬细胞中METTL4的降解成功应用于动脉粥样硬化治疗。

8. PROTAC-PEM能够有效延缓AS

综上所述,该研究证实脂质刺激引起巨噬细胞中METTL4升高,通过线粒体表观遗传学介导线粒体功能损伤和炎症促进动脉粥样硬化。此外,研究者首次报道PEMMETTL4甲基转移酶活性抑制剂,工程化巨噬细胞膜包裹PROTAC-PEM可能是靶向动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的有效治疗药物。本研究揭示了动脉粥样硬化病程进展的线粒体表观遗传新机制,并为动脉粥样硬化的治疗提出一种新的治疗策略。

原文链接:

https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.124.069574

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