腺嘌呤碱基编辑器(ABE)是在CRISPR/Cas9基础上衍生的基因编辑工具，能够实现基因组中A•T到G•C碱基的转换。ABE可以纠正基因突变或消除翻译后修饰，具有心脏基因治疗的潜力1。但是受到序列环境和染色质可及性等因素影响，ABE的编辑效率是高度可变的并且难以预测，这使得在指定靶碱基的情况下，ABE基因编辑的成功率有限。相比之下，利用ABE进行基因沉默成功率更高，因为这种策略可以靶向基因的起始密码子和剪接位点设计多条sgRNA并进行筛选。目前唯一在临床上得到验证的ABE心血管基因编辑药物即采用基因沉默的策略(NCT05398029)。
ABE在心脏中应用的另一大限制在于其较大的体积。受到AAV载荷限制，双AAV载体是目前心脏ABE递送的主要工具2，这限制了AAV基因治疗的递送效率、安全性和成本。基于小型化Cas9变体的ABE可以被单AAV装载，但这些小型化的ABE能否高效地应用于心脏尚不清楚。单AAV载体在心脏基因编辑中是否确实优于双AAV缺乏实验证据。
为了解决这些问题，北京大学郭宇轩研究员联合安贞医院高霏教授在Circulation Research发表题为“ABE-Mediated Cardiac Gene Silencing via Single AAVs Requires DNA Accessibility”的文章，开发了单个AAV递送的心肌特异性的单碱基编辑技术，强调其在心脏基因沉默中的应用，以及可能受心肌特异性染色质可及性的调节3。作者首先采用了SaKKH、Nme2Cas9、SauriCas9和CjCas9等4种小型Cas9构建的ABE4，选择心脏疾病的广谱治疗靶点CaMKIIδ的编码基因Camk2d作为靶基因，靶向Camk2d的起始密码子和5’剪接位点(5’SS)设计了18条sgRNA。在N2a细胞中筛选确定了SauriABE的具有高编辑活性的sgRNA1、6、7 (图A(1))。
在体内实验中，为了尽可能节省AAV中的空间，作者使用了较小的心脏特异性Myl2启动子(<300bp)5。对出生后1天(P1)的小鼠皮下注射了携带ABE基因组的AAV9 (1x10^11vg)，并在P7收集心室组织用于扩增子测序。结果表明，sgRNA7表现出最好的编辑效率和心脏特异性，并且优先编辑5’SS腺嘌呤而不是旁观者腺嘌呤(图B)。
接下来，作者分析了多个公共数据库中的ATAC-seq和DNase-seq数据，比较3条sgRNA靶向位置的染色质开放程度。结果表明，sgRNA7靶向的基因位置在心脏中是开放的，而肝脏中不开放，与sgRNA7独特的心肌特异性活性一致。这表明sgRNA的器官选择性与组织特异性染色质开放有关(图C)。
作者进行的逆转录-PCR (RT-PCR)结果表明，sgRNA7处理组Camk2d mRNA表现出内含子7保留增加，Sanger测序在RNA层面证实了对内含子7的5’SS编辑(图D(1))。RNA-seq进一步验证了内含子7保留增加，并且Camk2d的总mRNA显著下降，这可能是无义突变介导的mRNA衰变导致的(图D(2))。与RNA变化一致，Western blot也验证了CaMKIIδ蛋白降低(图D(3))。
接下来为了对比单AAV与双AAV系统，作者构建了三种双AAV载体作为对照，分别是：携带单个U6-sgRNA7拷贝(V1)和携带两个U6-sgRNA拷贝(V2)的双AAV-SauriABE载体，以及携带两个U6-sgRNA拷贝的SpCas9-ABE (图E(1))。作者进行了一系列的AAV剂量梯度实验，并分析“量-效”关系。结果表明在所有剂量下，单AAV的编辑效率和蛋白敲除效果都优于双AAV (图E(2-3))。
最后作者对比了新生和成年小鼠的编辑效率，发现新生阶段的编辑效率高于成年阶段(图F(1))，这与成年小鼠心脏中较低的染色质可及性相关(图F(2))，并且无法通过增加AAV剂量来克服。
总之，本研究表明，利用多样化的Cas9同源物可以通过筛选大量sgRNA，促进单AAV递送的心脏碱基编辑并进行基因沉默，提高ABE在心脏中应用的成功率。本研究的结果提示染色质可及性等表观遗传特征可能会对基因编辑结局产生器官特异性和年龄依赖性的影响，在未来设计心脏基因编辑策略时应系统评估。同时，本研究提供了实验证据证明在心脏基因编辑中单AAV相对于双AAV载体有优势。
北京大学基础医学院2021级博士生刘占钊和杨璐梓是本研究的共同第一作者，2020级基础医学八年制本科生杨喻涵在生物信息学分析中提供了重要帮助。北京大学郭宇轩研究员和北京安贞医院高霏教授是本研究的通讯作者。本工作获得了北京大学赵东宇研究员和北京协和医院胡晓敏研究员的大力支持与合作。本研究获得国家自然科学基金、国家重点研发计划和北京安贞医院高水平研究基金的资助。
参考文献：
1. Reichart D, Newby GA, Wakimoto H, Lun M, Gorham JM, Curran JJ, Raguram A, DeLaughter DM, Conner DA, Marsiglia JDC, et al. Efficient in vivo genome editing prevents hypertrophic cardiomyopathy in mice. Nat Med. 2023;29:412-421. doi: 10.1038/s41591-022-02190-7
2. Lebek S, Chemello F, Caravia XM, Tan W, Li H, Chen K, Xu L, Liu N, Bassel-Duby R, Olson EN. Ablation of CaMKIIdelta oxidation by CRISPR-Cas9 base editing as a therapy for cardiac disease. Science. 2023;379:179-185. doi: 10.1126/science.ade1105
3. Yuan T, Wu L, Li S, Zheng J, Li N, Xiao X, Zhang H, Fei T, Xie L, Zuo Z, et al. Deep learning models incorporating endogenous factors beyond DNA sequences improve the prediction accuracy of base editing outcomes. Cell Discov. 2024;10:20. doi: 10.1038/s41421-023-00624-1
4. Davis JR, Wang X, Witte IP, Huang TP, Levy JM, Raguram A, Banskota S, Seidah NG, Musunuru K, Liu DR. Efficient in vivo base editing via single adeno-associated viruses with size-optimized genomes encoding compact adenine base editors. Nat Biomed Eng. 2022;6:1272-1283. doi: 10.1038/s41551-022-00911-4
5. Bilal AS, Blackwood EA, Thuerauf DJ, Glembotski CC. Small Nppa and Myl2 Promoters Are Sufficient to Maintain Chamber-specific Expression on an AAV9 Platform. Faseb J. 2020;34. doi: 10.1096/fasebj.2020.34.s1.07372
附1：首都医科大学附属北京安贞医院高霏课题组科研助理招聘启事
课题组负责人：高霏，主任医师，北京安贞医院心内科冠心病中心八区副主任。从事心血管疾病介入治疗及临床转化研究。荣获首届“国家优秀青年医师”、“北京市优秀青年人才”、欧洲心脏病学会“青年研究”奖。入选北京市科技新星计划、北京市青苗人才计划、北京市优秀人才计划。主持国家自然科学基金、北京市自然科学基金重点研究项目等十余项。近五年以第一/通讯作者在European Heart Journal、Circulation Research、Science Advances等高水平杂志发表学术论文，H指数23。研究结果被写入美国心脏病学会(ACC)经皮冠状动脉介入治疗指南，以及美国胸科协会(ACCP)房颤诊疗指南。
现因科研工作需求，拟招聘科研助理1-2名。具体要求如下：
1. 岗位职责：
(1) 协助科研人员完成课题研究；
(2) 课题组科研平台建设；
(3) 承担实验室公共职责。
2. 应聘条件：
(1) 具有基础医学、生物技术、生物信息学、分子生物学、细胞生物学、实验动物相关专业背景；
(2) 硕士及以上，或优秀的本科毕业生，可独立完成常规的生物实验操作。
3. 相关待遇
对聘用人员提供具有竞争力的薪酬及福利，社会基本保险按国家政策执行。具体视个人背景和能力而定，优秀者待遇从优。
4. 联系方式
应聘者请将个人简历以及能证明本人能力的相关材料发邮件至：fgaomd@163.com，邮件主题为：个人姓名+应聘。应聘资料恕不退还，但将予保密。
附2：北京大学心血管研究所郭宇轩课题组博士后招聘启事
研究平台：北京大学心血管研究所位于北京大学医学部校区，成立于1984年，为首批原卫生部重点实验室。北京大学心血管研究所、北京大学第三医院血管医学研究所、北京大学基础医学院生理学与病理生理学系联合，于2002年成立分子心血管学教育部重点实验室，于2023年获批组建血管稳态与重构全国重点实验室。北京大学心血管研究所以心血管基础研究为核心，密切联系临床，具有明显的学科交叉以及 “基础-临床”全链条式布局研究的特点。现任所长为中国工程院院士董尔丹研究员。
合作导师：郭宇轩，博士生导师，北京大学心血管研究所研究员，血管稳态与重构全国重点实验室PI。北京大学生命科学学院本科，约翰霍普金斯大学生物学博士，哈佛医学院博士后。代表性的研究成果包括：(1)开发基于AAV的心脏基因编辑和基因治疗平台技术；(2)揭示心肌细胞成熟的调控机制与心脏疾病的发育源头；(3)建立心脏基因替代、细胞保护、组织再生等基因治疗策略。作为通讯作者在Circulation、Circulation Research、Cardiovascular Research等心血管主流期刊上发表论文，ESI高被引文章2篇。国家优秀青年科学基金项目获得者(2022)，北京市科技新星(2021)，负责国家重点研发计划、国家科技重大专项、国家自然科学基金等8项课题，曾获NIH K99/R00基金资助。现任中国病理生理学会心血管专业委员会委员、Fundamental Research杂志青年编委等。
研究方向：
1. 基于AAV的新型体内基因递送技术开发
2. 围绕心血管疾病的体内基因治疗策略研究
3. 针对心脏基因疗法的体外微生理系统评估
应聘条件：
1. 两年内获得或确定将获得博士学位，品学兼优，身体健康。
2. 为人正派，作风严谨，热爱科研，具有良好沟通能力和管理能力，富于团队意识。
3. 具有良好的实验技能和英文阅读写作能力，能在导师指导下独立完成研究工作。
4. 具有大规模平行报告实验和生信分析经验者优先，具有类器官/器官芯片经验者优先。
5. 年龄原则上不超过35岁。
岗位待遇：
1. 薪酬福利：
(1) 国家资助A档(“博新”)博士后税前年收入约41万元(含单位公积金)；
(2) 博雅博士后税前年收入约30万元(含单位公积金)；
(3) 国家资助B档博士后税前收入约28万元(含单位公积金)；
(4) 普通全职博士后税前年收入约21万元(含单位公积金)；
在站满一年工作表现突出、成果显著的博士后可享受博士后年终绩效。在站第3年的基本年薪提高2万元。合作导师为优秀博士后发放项目酬金。按照国家和学校有关规定，缴纳社会保险和公积金。根据工作表现和实际情况，课题组提供额外奖金。
2. 住房：博士后可申请博士后公寓，租住公寓者按照市场价缴纳房租。按照博士后类型享有不同的优先分配权。
3. 各类基金申请：鼓励博士后申请各类人才项目、研究经费或奖励经费。如国家资助博士后研究人员计划，香江学者计划、澳门青年学者计划、国际交流计划学术交流项目和医学部博雅博士后等项目，以及国家自然科学基金、北京市自然科学基金、中国博士后科学基金等。
4. 职业发展：鼓励和支持博士后的自主创新，根据学科发展和工作需要，优秀博士后符合条件可申请北京大学医学部预聘制教职。
5. 户口：非京籍博士后可将户口迁至北京大学医学部集体户。博士后出站满足落户条件的，其配偶、子女户口可以随迁。
6. 子女入园、入学：符合属地子女入园、入学政策的博士后，凭全国博管办介绍信可以办理子女入幼儿园、上小学和初中。
应聘材料：
1. 个人简历(包括教育经历，工作经历，学术成果及获得奖励)；
2. 两份专家推荐信(包括博士导师)及推荐专家的联系方式；
3. 介绍既往工作的主要研究内容及博士后阶段的工作规划
申请方法：
1. 个人简历及相关申请材料发送至：guo@bjmu.edu.cn，邮件标题注明"博士后应聘+姓名"。
2. 综合考察应聘者材料，择优组织面试。北医博士后进站时间一般为每年1月、4月、7月、10月，请应聘者注意安排时间。
更多信息见北京大学基础医学院网站：
https://sbms.bjmu.edu.cn/zpxx/68a5302e9c414fb2bfc26c684ebbb886.htm
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