线粒体病是一类重要的遗传代谢病，其发病可覆盖全年龄段，尤其是儿童线粒体病致死致残率极高。随着生物化学及分子与细胞生物学技术的发展，线粒体病的实验室诊断经历了快速的发展，相关诊断路径和策略也从高度有创的实验室检测逐渐过渡到以无创筛查为主。但是，线粒体病实验室诊断仍然存在单一检测策略的阳性诊断率不足、实验室漏检与待排查比例居高不下的困扰，因此新的线粒体病检测技术被开发并用于协助疾病的诊断。该文从基因、酶生物化学与代谢生物学3个层面对当前线粒体病实验室诊断的进展进行综述，旨在为特定场景下线粒体病实验室诊断策略选择提供参考，也为后续检测技术的研发提供一些建议。
方合志教授以通信作者在《国际检验医学杂志》发表《线粒体病分子诊断技术进展》一文，文章介绍了线粒体病的生物化学与细胞生物学机制，围绕线粒体及线粒体病、当前线粒体病诊断的主要策略及线粒体病分子诊断技术对线粒体病的诊断技术进展进行综述。
专家简介
沈丽君，王娅，周怀彬，陈连婷，蔡雯，方合志△
浙江省医学遗传学重点实验室/温州医科大学检验医学院(生命科学学院)，浙江温州325035
1962年LUFT首次报道了线粒体病，患者的症状主要表现为非甲状腺高代谢、近端无力，电镜检查肌肉组织线粒体结构异常，以及肌细胞线粒体OXPHOS功能异常，线粒体病开始进入人们视野。1988年HARDING所在研究团队[5]在“线粒体肌病”患者活检肌肉组织中检出mtDNA大片段缺失，同年WALLACE团队[6]在一个Leber遗传性视神经病变（LHON）家系中发现首个致病性mtDNA突变（MTND4基因，点突变），自此拉开了线粒体病遗传学和病因研究的序幕。而随着一代测序技术及2010年代二代测序技术发展，层出不穷的测序技术已经成为线粒体病实验室诊断的主要方式[7]。随着测序成本的不断下降，有创活检已不再是线粒体病实验室诊断的第一选择。高通量测序完成初筛，再结合临床有选择的开展活检是当前线粒体病实验室诊断的趋势。近年来，随着蛋白质组学与代谢组学技术的进一步发展，利用多组学技术发现高灵敏度和高特异性的无创血液标志物正逐渐成为实验室诊断的可选方案之一[8]。
本文将介绍线粒体病的生物化学与细胞生物学机制，并概述线粒体病诊断技术的发展历程。
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线粒体及线粒体病
1.1线粒体
线粒体蛋白由nDNA和mtDNA共同编码，包含约1100个核编码基因和37个线粒体编码基因[9]。mtDNA为双链闭合环状DNA，全长约16 kb，包括一个控制区（D-Loop）和37个编码基因。这些基因分别编码2个rRNA，22个tRNA和13个呼吸链复合体亚基[10]。除此以外，线粒体的其他蛋白均由nDNA编码，在细胞质合成后转运进入线粒体[11]。
线粒体病种类繁多，共包括300多种疾病亚型，其中常见的是Leigh 综合征、线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作（MELAS）、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维（MERRF）、Leber遗传性视神经病变（LHON）、Alpers-Huttenlocher综合征、母系遗传性耳聋、母系遗传性糖尿病及mtDNA耗竭综合征（MDDS），见表1。
表1 常见线粒体病（亚型）致病变异、发病年龄与临床表型注：KSS（Kearn–Sayres syndrome）；PS（Pearson Syndrome）；CPEO（chronic progressive external ophthalmoplegia）；MELAS（mitochondrial encephalopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes）；MERRF（myoclonic epilepsy with ragged red fibres）；LHON（Leber’s hereditary optic neuropathy）；NARP（neurogenic weakness with ataxia and retinitis pigmentosa）；AHS（Alpers-Huttenlocher syndrome）。
线粒体病临床表型复杂，缺乏特征表型。由于线粒体受nDNA和mtDNA双重调控，且mtDNA突变又存在异质性和阈值效应，因此线粒体病发病原因、临床表型都极为复杂。线粒体病常见的临床表型包括上眼睑下垂、外眼肌麻痹、近端肌病、运动不耐受、心肌病、感音神经性耳聋、视神经萎缩、色素性视网膜病变、糖尿病、癫痫发作、中风样发作、共济失调和痴呆等[14]。但这些症状并非线粒体病的特征表型，而是与其他疾病相似的症状，这也使得线粒体病临床诊断极为困难。下文将从受累遗传物质、患者发病年龄、受累器官和生化特征等多方面对线粒体病进行分类介绍，这将有助于诊断过程中对线粒体病病因的查找。
根据受累遗传物质的不同，线粒体病可划分为mtDNA变异引起的线粒体病和nDNA变异引起的线粒体病，二者遗传方式大为不同。mtDNA突变相关线粒体病往往表现为母系遗传（如LHON），而nDNA突变线粒体病则遵循孟德尔遗传方式（如Alpers-Huttenlocher综合征）。此外，也有一些子代的新生突变可直接导致疾病的发生[13]。无论哪一种类型的突变，氧化磷酸化功能缺陷是线粒体病的主要生化特征。
根据患者发病年龄，线粒体病可划分为儿童线粒体病（年龄<16岁）与成人线粒体病。二者除发病年龄差异外，在疾病的严重程度上也存在差异。儿童线粒体病相对而言病情较重，常伴随严重的神经系统退行性病变，具有发病早、多器官累及、进展快速及死亡率高等特点，且98%儿童线粒体病患者具有儿童线粒体脑病特征[17]。儿童线粒体病亚型中最常见的为Leigh综合征，常在婴儿期或幼儿期发病，并表现为发育迟缓和神经退行性变[18]。成人线粒体病患者病情相对较轻，例如慢性进行性眼外肌麻痹、耳聋和糖尿病等，此外也可能表现为神经系统退行性病变[1, 18]。此外，就发病原因而言，儿童原发性线粒体病通常由nDNA突变引起（占儿童线粒体病患者70%~75%），并遵循孟德尔遗传规律；而成人线粒体病更多的是由mtDNA突变引起[18-19]。通常情况下，当同为mtDNA致病时，儿童线粒体病患者mtDNA突变异质率往往高于成年发病的患者[19]。
根据生化特征划分，OXPHOS功能缺陷相关线粒体病可分为原发性线粒体病（PMD）和继发性线粒体病（SMD）。PMD为一系列引起线粒体OXPHOS功能障碍的遗传性疾病的总称，可直接由线粒体呼吸链各蛋白亚基编码基因突变所致，亦可由参与OXPHOS运行的其他组分编码基因突变所致，从而导致细胞产能缺陷[15]。SMD则为除PMD之外的线粒体功能异常所致的疾病，如SMN1基因缺陷引起的脊髓性肌萎缩、FXN基因缺陷引起的Friedreich共济失调等[16]。
根据受累组织器官的不同，线粒体病又可分为单一器官受累线粒体病（如LHON和感音神经性耳聋）和多器官受累线粒体病（常伴有神经系统病变和肌病，如线粒体脑肌病）。
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从最初的有创活检、血浆生化标志物检测，到现在的“临床初诊+基因检测+有创活检”，临床科研工作者一直在探寻更高效的无创新方法。当前在初步怀疑为线粒体病的情况下，首先根据线粒体病诊断标准（MDC）对患者进行评估打分。MDC可以通过评分量化线粒体相关疾病的患病概率，有助于将线粒体病与其他多系统疾病进行区分，并决定是否需要进一步的诊断[20-21]。线粒体病的常规诊断包含以下几个方面：临床影像学检查、体液（血液、尿液、脑脊液）生化检测、基因测序、组织病理与酶学检测。表1列举了常见线粒体病、发病年龄及临床表型。临床初诊患者符合相应症状时应怀疑线粒体病并进行进一步检测以确诊。但是，通常情况下，多数线粒体病患者并不具有这些易于识别的临床表型，从而造成漏诊。因此，当患者存在多器官受累和/或母系遗传特征时，也应怀疑线粒体病，并做进一步检查。线粒体病常规诊断策略流程示意图见图2。
线粒体病的诊断是一个复杂而耗时的过程，NIH最新的一项研究显示，线粒体病患者从症状出现到确诊平均耗时约10年，期间平均需经历6.7个医生[22]。而线粒体病诊断一直存在困境，单一方法很难对线粒体病进行确诊。比如很大一部分怀疑线粒体病的患者血液标本中根本无法检测到已知的致病性mtDNA突变，基因检测检出率低。另外，线粒体病不具有典型的临床表型，且常与其他疾病具有交叉相似的临床表型，单靠临床诊断往往无法确诊。因此，目前常规的诊断路径是采用“临床初诊+基因检测+有创活检”三者相结合的方式。这三者中，随着分子诊断技术的发展，其以无创、快速、便捷等特点成为了当前线粒体病诊断的核心部分。但是目前这种联合模式下线粒体病的诊断率也仅50%左右。开发新的检测手段，寻找灵敏度高、特异性强的检测标志物将是今后线粒体诊断研究的重要方向。
注：MDC为线粒体病标准；MD为线粒体病；VUS为意义未明变异位点；OXPHOS为氧化磷酸化；mtDNA为线粒体DNA。
图2 线粒体病实验室诊断常规流程图
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3.1 基于基因的线粒体病诊断
过去数十年间，在已知的近1 200个线粒体定位蛋白中，已经确证的有400余个基因缺陷与线粒体病相关。因此，除这400余个基因外，仍有相当大量的基因变异是潜在的线粒体病致病基因，并有待进一步进行功能验证。早期线粒体病基因诊断是根据患者的症状以及皮肤或肌肉活检的结果，预测可能的突变基因，并利用Sanger测序对候选基因进行逐一排除。例如针对mtDNA变异常见的有mtDNA大片段缺失（KSS和PEO）、m.3243A>G（MELAS）、m.11778 G>A（LHON）和m.8344 A>G（MERRF）等；针对nDNA变异常见的有POLG、SPG7和OPA1等基因突变。但由于线粒体病患者常不具有典型的临床表现，因此确定候选基因十分困难，且确诊率低。随着二代测序技术的发展，DNA测序的精度和深度不断提升，同时费用逐步降低，因此二代测序目前已成为线粒体病诊断中至关重要的工具。
利用外周血样本进行二代测序大大提高了基因诊断的效率。并且将高通量的二代测序前置，亦可以减少有创活检给患者带来的痛苦。根据是否有明确的候选基因，可以选择Targeted panels测序、全外显子测序（WES）或全基因组测序（WGS）。当患者高度怀疑为线粒体病，且有比较明显的临床表型（如符合MELAS、MERRF、LHON、Pearson综合征等症状），或者经济条件限制，此时可针对目的基因进行Targeted panels测序；当患者没有比较明显的符合常见线粒体病的症状同时又怀疑线粒体病，又或者Targeted panels测序结果为阴性时，则应考虑WES或WGS，若怀疑nDNA变异引起的线粒体病可选择WES，否则可选择对核基因和线粒体基因组同时检测的WGS。虽然二代测序的高效性使得线粒体病的检出率达到16%~60%，但也伴随着诸多问题，例如检测周期长、费用高昂及外显子中高GC区域难测通等。
3.2 基于蛋白分子的线粒体病诊断
虽然二代测序技术提高了线粒体病的基因诊断率，但无法对线粒体病进展、严重程度以及预后进行评估。基于蛋白质组学的检测技术可以在一定程度上弥补这一缺陷。下文将对用到的基于蛋白分子的诊断技术进行概述。
3.2.1基于线粒体OXPHOS复合体含量的检测技术
BN-PAGE是一种可以分离并测定线粒体膜蛋白复合物（主要为内膜上呼吸复合体）在天然状态下的含量和结构完整性的方法[23]。该方法具有所需标本量少，操作简便，耗时短等优点，因此可针对有创活检标本和原代培养细胞开展检测。目前广泛认可的理论是线粒体内膜上的呼吸链复合体不仅以单体形式存在，也可以超级复合体（SCs）和呼吸体的形式存在[24]。复合体的装配成熟，以及超级复合体和呼吸体的组装成熟均需要各种组装因子的参与。当复合体含量和装配环节出现问题，便可在BN-PAGE的电泳条带上得以反映。因此，BN-PAGE也得以在线粒体病的诊断中应用，尤其是在OXPHOS障碍引起的原发性线粒体病诊断方面，BN-PAGE可以提供丰富的信息，诸如复合体含量、大小、复合体，以及超复合体组装情况等[25]。
3.2.2基于质谱的蛋白检测技术
1998年，科研人员利用双向电泳结合质谱技术对线粒体进行蛋白质组学的研究，并试图利用正常组织与疾病组织进行对比，寻找线粒体病的诊断性标志物。双向电泳虽然可以直接对样本蛋白质丰度的改变进行比较，但其在膜蛋白、高相对分子质量和低相对分子质分子量蛋白的分离，以及低丰度蛋白分离方面存在不足，限制了双向电泳-质谱技术在临床线粒体病研究中的应用[26]。近年来，随着串联质谱的发展及色谱-质谱技术的进步，上述困难已成功克服，极大推动了线粒体蛋白质组学的研究。该方法主要针对患者血液或尿液样本开展检测研究。例如，通过对MELAS患者血浆进行检测发现了多个显著区别于对照组的蛋白及代谢标志物，且这些标志物大部分与疾病的严重程度高度相关[27]；而对线粒体病患者尿液进行检测分析，可以发现其与健康人的尿液存在截然不同的代谢特征[28]。
3.2.3复合体组学技术
复合体组学技术通过将BN-PAGE、色谱或密度梯度离心等分离方法与串联质谱相结合，应用于蛋白的鉴定和定量分析，实现了对患者样本中OXPHOS复合体蛋白丰度，以及蛋白相对分子质量变化的分析[29]。在线粒体病诊断研究中，该技术主要应用于针对OXPHOS组装动力学的研究，即突变导致复合体组装异常的分析。该方法常以线粒体病患者和健康对照来源的成纤维细胞或线粒体病细胞模型为样本来源[30-32]。
3.2.4酶学检测技术
很大一部分线粒体病是由OXPHOS复合体功能缺陷引起，因此对组织或细胞OXPHOS复合体的酶学检测是线粒体病诊断研究的一个重要方面。酶学检测技术主要针对有创活检标本进行酶学检测，亦可针对皮肤来源或淋巴细胞来源的细胞系开展OXPHOS酶学检测。目前已知超过400个基因突变可导致OXPHOS功能缺陷。尽管目前二代测序仍是线粒体病检测的首选手段，但其诊断成功率仍不能满足诊断要求，此外，发现的大量意义未明的突变仍需进行功能验证。因此，基于OXPHOS功能的酶学检测目前仍是线粒体病诊断的重要组成部分。其中，呼吸复合物酶动力学检测主要通过加入待测复合体的底物，利用酶标仪检测反应前后体系吸光度的变化，实现对酶活性的分析。该方法即可分析复合体I~V单一酶活性，亦可检测多个酶的联合活性，例如复合体II+复合体III联合测定可用于诊断泛醌缺乏症[33]。酶组织化学检测则是基于有创活检的组织线粒体酶学和形态学的一种检测方法。该方法曾经一度是线粒体病检测的金标准，并为线粒体病的诊断提供可靠的依据[34]。随着基因检测技术的进步，酶组织化学分析虽然不再作为首选检测手段，但在其余检测手段均无法确诊的情况下，会考虑采用该方法。胶内酶活分析是一种方便有效的对超级复合体组分进行分析的方法。该方法首先利用BN-PAGE电泳分离呼吸复合体。由于这一过程中复合体的空间结构以及蛋白相互作用未被破坏，复合体仍具有酶活性，此时给与复合体相应的底物以及显色剂对电泳后的凝胶进行酶活染色，从而达到检测待测组织或细胞OXPHOS组分构成和能量代谢状态的目的[35]。
3.2.5除OXPHOS复合体外的其他蛋白检测
由于不同蛋白的功能差异较大，目前并没有统一的检测方式。然而，除了OXPHOS复合体亚基和组装因子，以及电子传递载体细胞色素C和辅酶Q缺陷外，大量其他蛋白缺陷，如SERAC1、PDHA1、FBXL4、POLG2和OPA1等，也会导致OXPHOS缺陷相关线粒体病。因此，很多时候也可以通过OXPHOS缺陷分析结合基因检测来发现一些新的线粒体病致病蛋白，进而拓宽线粒体病致病基因突变谱，为线粒体病诊断提供一定依据。
3.3 基于代谢的线粒体病分子诊断
线粒体病诊断的另一个指标是乳酸/丙酮酸比值。乳酸和丙酮酸分别是丙酮酸脱氢酶的产物和底物，正常情况下乳酸/丙酮酸比值（L/P）≤10，而当细胞处于缺氧、氰中毒或OXPHOS功能障碍时，堆积的丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下转化为乳酸，导致细胞L/P上升[40]。L/P比值受解离常数K、NADH/NAD+比值和细胞质pH值影响，因此L/P常用以间接反应细胞的氧还状态（NADH/NAD+），可作为OXPHOS功能障碍的指标。当L/P＞25时，提示OXPHOS功能障碍[40-42]。但由于丙酮酸在体外不稳定，容易造成结果L/P比值偏大；而在某些情况下（如急性酮症酸中毒、慢性肾衰或呼吸衰竭）细胞pH值急剧降低，亦可造成L/P比值失真[43]。此外，也有研究显示，乳酸水平及L/P比值在儿童肝衰患者中也普遍升高，并不仅限于线粒体病[38]。因此，目前在线粒体病诊断中乳酸水平及L/P比值仅可作为参考指标，而无法作为诊断依据。
3.3.2细胞因子成纤维细胞生长因子-21（FGF21）与生长分化因子15（GDF15）
长期以来，人们一直致力于寻找线粒体病的血液检测标志物，但是除了乳酸和丙酮酸之外收效甚微。近年来，有研究显示，血液中FGF21水平对线粒体病及其进展的严重程度有指示性意义[44]。FGF21主要在肝脏、脂肪组织和骨骼肌等部位合成，并参与调控机体的脂质代谢和饥饿反应。FGF21水平受线粒体综合应激反应（mitoISR）调控，当OXPHOS功能缺陷时，细胞mitoISR激活，并刺激下游FGF21高表达。高表的FGF21随后通过调控线粒体稳态、线粒体功能等方式实现细胞的代谢适应[45-47]。当在线粒体病患者OXPHOS功能缺陷的情况下，骨骼肌细胞FGF21表达水平升高，代偿性增强骨骼肌细胞的线粒体功能，因此可以在患者体液中检出FGF21水平升高[45]。大量研究认为FGF21值可作为以肌肉受累为主要表型的线粒体病标志物（尤其对mtDNA维持障碍和mtDNA片段重排引起的线粒体肌病），而且FGF21与疾病的进展具有相关性[44, 48-51]。但也有研究指出，FGF21水平与线粒体病的进展并无显著相关性[52]。作为诊断标志物而言，FGF21虽然足够稳定，也具有很高的敏感性，但仍缺乏特异性，例如在糖尿病、肝病、肾功能不全、肥胖或代谢综合征患者中FGF21水平同样上升[36, 53-54]。虽然存在上述不足，但FGF21作为线粒体肌病的检测指标仍具有一定的临床意义，在怀疑线粒体肌病的前提下，检测血清FGF21水平，并结合二代测序，可以很好的检出线粒体肌病。
GDF15作为细胞因子的一种，受p53和氧化应激调节，属于人类转化生长因子β超家族。GDF15主要在胎盘、肾、肝、肺、胰腺和前列腺等组织表达，并进入血液。在炎症反应情况下，GDF15水平会升高[55-56]。近年来，血液GDF15水平常和FGF21一起作为线粒体病新的候选标志物，并且GDF15似乎比FGF21具有更高的敏感性。但与FGF21不同的是，GDF15对OXPHOS缺陷的指示性与疾病的临床表型无关[50]。与FGF21相似的是，GDF15同样既缺乏特异性，在一些非线粒体病患者血液中也可检出GDF15水平升高[44]，也无法指示线粒体病的进展[57]。因此，在今后的工作中，应该就FGF21和GDF15的特异性开展进一步研究。
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总结与展望
由于线粒体病包含大量疾病亚型，受限于线粒体病的临床表型复杂性与异质性，大量的线粒体病患者在明确其存在线粒体功能缺陷后，仍只能简单地诊断为线粒体肌病、脑肌病或脑白质病等。而基于有创活检的线粒体酶学或线粒体形态学评估一度被认为是线粒体病诊断的金标准，但活检存在较高的假阴性率与假阳性率，例如经基因检测确诊的儿童线粒体病中，其肌肉活检线粒体功能缺陷的阳性率一度只有60%[17]。反之，在一些非线粒体病患者中发现26%的患者存在线粒体功能异常，提示有创肌肉活检尚存在较高的假阳性率[58]。而二代测序方法虽然可以实现高通量大规模的基因筛查，但其同样存在诊断率不高，且耗时长等缺点。目前的诊断模式——临床初诊+基因检测+有创活检，只能确诊约50%的线粒体病患者，未能被确诊的仍只能归类在临床高度疑似线粒体病之列。因此，开发无创、高效的线粒体病诊断标志物具有深远的临床意义。研究发现，线粒体病患者的尿液和血液中存在与健康人截然不同的代谢特征，并且一些代谢特征的改变可用于提示线粒体病的进展和严重程度[27-28]。因而，除检测经典的生物标志物乳酸和丙酮酸外，充分关注线粒体病患者的代谢特征，寻找更具特异性的标志物，有可能改变目前的诊断模式。这将使患者免除有创活检的痛苦，减轻全外显子测序的负担，缩短线粒体病临床检验诊断的时间，并进一步提升临床检验诊断与干预治疗的时效性。
参考文献略
编辑：宣艳艳 审校： 张耀元
